Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)
Fundamentos
La HPLC es una técnica cromatográfica en la que la fase móvil (FM) es un líquido y la fase estacionaria (FE) puede ser líquida, sólida, una resina de intercambio o fases porosas (poliméricas o de sílice). Se lleva a cabo en columnas de vidrio con un diámetro (D) de 1 a 5 cm y una longitud (L) de 50 a 500 cm. Para asegurar caudales razonables, el diámetro de las partículas de la FE sólida era de 150 a 200 μm y se realizaban por gravedad. En consecuencia, los tiempos de separación eran demasiado largos, la sensibilidad era baja y el consumo de disolvente era alto.
Los científicos se dieron cuenta de que podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamaño de las partículas de relleno del orden de 3 a 10 μm. Al ser las partículas más pequeñas, el empaquetamiento de la FE es mucho mayor y opone más resistencia al paso de la FM. También se ayuda de bombas de alta presión (200 atm). Las ventajas de la HPLC son una alta eficacia, mayor sensibilidad, un tiempo de análisis mucho más corto y un reducido consumo de disolvente.
Instrumentación
Bombas
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC incluyen:
- Deben ser construidas con materiales inertes a los disolventes empleados.
- Deben suministrar flujos entre 0,1 y 10 ml/min libres de pulsaciones.
- Generar presiones superiores a 6000 psi.
La presión durante el proceso debe permanecer estable. Si esto no ocurre y la presión baja, puede ser debido a una mala conexión o a que en la bomba haya aire; también puede ocurrir que suba la presión por obstrucción en la columna.
Hay tres tipos de bombas:
- De jeringa o desplazamiento: poseen un contenedor con aproximadamente 200-500 ml de FM y se impulsa continuamente con el pistón. No produce pulsos. Produce caudales de μl/min en columnas de pequeño calibre. La única desventaja es que necesita reposición constante de disolvente.
- Reumáticas o de presión constante: las ventajas son que están exentas de pulsos y son baratas. Tienen inconvenientes como caudal dependiente de la viscosidad del disolvente, presiones limitadas (2000 psi) y no se usan para gradiente.
- Recíprocas: se usan para el 90% de los sistemas de HPLC. Un pistón de zafiro succiona la FM hacia la cámara (volumen máximo 400 μl) a través de una válvula sin retorno e impulsa la FM a través de la válvula de salida. Necesita un sistema de amortiguación de pulsos o trabajar con sistemas de doble pistón que funcionan de forma alterna. Produce flujos de ml/min y altas presiones (1000 psi) y son aptas para gradiente.
Inyector
El factor limitante en la presión de las medidas cromatográficas es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la medida. En HPLC, el método más utilizado para la introducción de la muestra utiliza bucles, que son dispositivos integrados en el equipo. Estos oscilan entre 2 y 1000 μl. La varianza en la inyección es constante y no es necesario un patrón interno. Comercialmente, estos inyectores se dice que son tipo Rheodyne.
Columnas
Las columnas para las HPLC son tubos de acero de entre L = 5-30 cm y Di = 4-10 mm con rellenos de partículas de 3,5-10 μm. Este tipo de columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo, partículas de la muestra o de los disolventes. Comercialmente son columnas de Ultra-HPLC o UPLC, estas columnas son Di = 1-3 mm, L = 5-15 cm y con partículas de relleno de 1,7 μm.
En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces sí se controla la temperatura de la columna para obtener mejores cromatogramas, su control aumenta la reproducibilidad del tiempo de retención (tR) y la precisión del análisis cuantitativo.
Precolumna:
Se sitúa a la entrada de la columna. Se usan para liminar materia en suspensión saturando la FM con FE para minimizar pérdidas en la columna. Mismo relleno pero mayor tamaño de partícula. Retiene fuertemente a analitos con gran afinidad por FE. La precolumna mas frecuente tiene L=250m, d=4,6mm y tamaño particula=5μm.
Efecto de la Tº en columnas (aumento): – Disminuye la viscosidad del disolvente, reduciendo la presión requerida o permitiendo mayor caudal – Se acortan los tiempos de retención – Mejora la resolución (aumenta la velocidad de distribución de los solutos entre FM-FE) – Puede degradar la FE y reducir la vida de la columna.
-Detectores: Monitorizan el eluato de la columna y genera una señal eléctrica proporcional a alguna propiedad de los analitos o de la FM. Caracteristicas de un detector ideal: 1)Sensibilidad adecuada 2)Estabilidad y reproducibilidad de medida 3)Respuesta lineal 4)Rápida respuesta 5)Ajustable como Universal o Selectivo para alguna clase especifica de analitos 6)No destructivo
TIPOS de detectores: ·Detector espectrofotometrico de absorcion UV-Vis: absorbe la radiación UV-Vis por parte de los compuestos eluidos de la columna. El compartimento de muestra es una celda de flujo en forma de Z (1-10 µL) que permite la entrada y salida continua de muestra. Es aplicable a sustancias insaturadas, anillos aromáticos, -C=O, -CN, -C=S. Es apto para elución en gradiente con un amplio rango lineal, muy sensible y con muchas aplicaciones. Longitud de onda fija (lampara de mercurio, filtro, fotodiodo), longitud de onda variable (lamparas de deuterio y wolframio, monocromador, fotodiodo), diodos en fila(se usa para la seleccion de onda adecuada para cuantificar cada analito, compara espectros con patrones) ·Detector de fluorescencia: mide radiación fluorescente emitida por un compuesto que se eluye de la columna. Usa lámpara de Xe o D2, monocromadores y Tubo Fotomultiplicador. Es muy sensible y selectivo. Se usa para compuestos fluorescentes o no fluorescentes derivatizados. ·Detector amperometrico: Se mide la corriente eléctrica cuando se oxidan (proc. Anódico) o reducen (proc. Catódico) los compuestos que se eluyen de la columna. Esta formado por 3 electrodos, uno de referencia (Ag/AgCl), otro auxiliar (acero) y otro de trabajo (C, Pt, Au o Hg). Detecta sustancias electroactivas (fenoles, aminas). Los LOD estan entre 0,01-1ng, es sensible a la variacion del caudal y la Tº. No se usa en gradiente. ·Detector de indice de refraccion: Basado en la medida del cambio del índice de refracción del efluente de la columna en relación a la FM. Si hay diferencia de índice de refracción el haz se desvía desplazando su punto de incidencia en el fotodetector, disminuyendo la corriente de salida. Es universal, poco sensible(100-1000ng), no se puede usar en gradiente, es muy sensiblea cambios en la presion y la Tº y posee un rango lineal poco amplio.
·Detector de dispersion de luz: Transforma el efluente de salida en un aerosol en un nebulizador (con N2 ). Se evapora el disolvente en un tubo calentado. Un láser es dispersado por las partículas sólidas. Medida a 90º en fotodiodo de Si. Los solutos son menos volatiles que la FM xlok precisamos de un tampon volatil. La señal es proporcional a la masa de analito y la respuesta no es lineal. Los LOD estan entre 0,1-1ng, es compatible con elucion en gradiente y no es selectivo. ·Detector de conductividad: Es universal para cromatografia ionica. Se basan en los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de analito. Están formados por una celda asilada que contiene dos electrodos sobre los que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla eluida, la cual está relacionada con su concentración. Su límite de detección se encuentra entre 0’5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse en elución en gradiente.
Cromatografia liquida-espectrometria de masa (HPLC-MS): Acoplamiento entre una tecnica de separacion y una tecnica de medida instrumental. Estos sistemas facilitan el analisis de muestras de analitos poco volatiles. Entre el equipo cromatográfico y el espectrómetro de masas tenemos que colocar una interfase para controlar lo que entra a éste. Caudal pequeño, porque si me sale mucho líquido es más difícil pasarlo a estado vapor. Evitar tampón porque también provoca ensanchamiento. Las técnicas de ESI (Ionización por electro nebulización) -> La ionización se produce aplicando una diferencia de potencial a un espray formado con el eluyente de la columna cromatográfica. Se forman iones quasi-moleculares que permiten establecer el peso molecular de la molécula. Y APCI (Ionización química a presión atmosférica) -> La ionización requiere la volatilización del analito presente en un espray formado con el eluyente de la columna cromatográfica. Se produce la ionización del disolvente debido a una descarga eléctrica y los iones formados ionizaran el analito. Se obtiene un espectro de masas de características similares a los obtenidos con ionización por Electrospray (ESI).
–Espectrometria de masas en tándem: Varios analizadores de masas en serie para aislar un ión que luego es fraccionado y vuelto a pasar por un analizador de masas. Es el caso del triple cuadrupolo (QQQ): Q1: enfoca el ión precursor; Q2: no actúa como analizador, sino como celda de colisión para producir mayor fragmentación; Q3: analiza los iones formados a partir del precursor
–Tecnicas: ·Barrido de iones-producto: MS1 selecciona ión precursor, MS2 fragmenta, MS3 analiza el espectro de los fragmentos formados ·Barrido de iones precursores: MS1 barre los distintos iones precursores, MS2 los fragmenta, MS3 selecciona iones de entre los fragmentos de cada precursor ·Barrido de pérdidas neutras: MS1 barre los distintos iones precursores, MS2 los fragmenta, MS3 barre los iones de cada precursor (que provienen de una pérdida neutra)
–Equipos: ·Triple cuatrupolo (QQQ) ·Cuadrupolo tiempo de vuelo(Q-ToF) ·MS/MS hibrido (doble enfoque-Q)
Fases estacionarias: –Cromatografia de adsorcion: alúmina, gel de silice o carbon activo. –Cromatografia iónica: resinas de intercambio. –Cromatografia de exclusion: fases porosas poliméricas. –Cromatografia de reparto: es el tipo de cromatografia de liquidos mas utilizado de las 4 modalidades. Casi todos los soportes de los rellenos se preparan con particulas microporosas de silice. La superficie de la silice totalmente hidrolizada esta constituida por grupos silanol (Si-OH). Segun la polaridad de la fase estacionaria existen dos tipos:
·Cromatografia de fase inversa: la FE es no polar (hidrocarburo) y la fase movil es polar (H2O,MeOH) tiene como ventajas que es de facil aplicacion, las FM son baratas, amplia polaridad de los solutos y puede usarse para solutos ionicos.
·Cromatografia de fase normal: utiliza de FE sustancias de elevada polaridad como el agua o el trietilenglicol soportadas por particulas de silice; y como FM se emplea un disolvente apolar como el hexano.
Las ventajas de la cromatografia de reparto son: amplia aplicacion, buena reproducibilidad, tiempos de equilibrado cortos, orden de elucion predecible. Los inconvenientes son que tienen un rango limitado de pH y colas en picos.
Fase movil: Son disolventes o mezcla de disolventes de elevada pureza. La elucion es la capacidad de una fase movil para desplazar un soluto de la fase estacionaria. Existen dos tipos de elución: –Isocrática: se emplea un solo disolvente de composicion cte. Φiso=Φo+(tR-to-tD)/tG ΔΦ (Φo: composicion inicial gradiente,0,05; ΔΦ:variacion del gradiente(0,95); tD tiempo de demora; tR:tiempo medio del primer y ultimo pico) to=(Ldc)2/2F (L:longitud columna; dc:diametro de la columna; F:caudal) –En gradiente: la composicion del disolvente varia durante la separacion para aumentar su fuerza eluyente. Φo’=Φo+(tA-to-tD)/tG ΔΦ Φf’=Φo+(tz-to-tD)/tG ΔΦ Caracterisricas de los disolventes de la FM: la viscosidad, la Tº de ebullicion debe ser muy alta xlok interesa ksea poco volatil, toxicidad baja, cut-off(longitud de onda por debajo de la cual A>=1), una polaridad adecuada para eluir a los analitos. Se producen interaccion entre la FM y el soluto, estas pueden ser: dipolo inducido-dipolo inducido, dipolo-dipolo, puentes de H, transferencia de cargas, interacciones ionicas. Podemos decir que lo semejante disuelve a lo semejante.
Aplicaciones
–Medicina y farmacologia: determinar principios activos o metabolitos, vitaminas. Analizar suero sanguineo, orina, heces, medicamentos
–Medioambiente: PAH’S, plaguicidas
-Industria alimentaria: carbohidratos, alcaloides, antioxidantes
–Derivatizacion: es un proceso el cual consiste en modificar quimi. un compuesto para producir un derivado con nuevas propiedades k faciliten o permitan su analisis. Mejora la volatilidad, estabilidad termica y la deteccion de analito. Existen dos tipos de dispositivos k permiten la derivatizacion: precolumna (se realiza antes de la separacion cromatografica. La velocidad y las condiciones experimentales son independientes del proceso cromatografico(off-line)). Post-columna(se coloca un dispositivo entre la columna y el gel detector para realizar la derivatizacion despues de la separacion cromatografica(on-line)).