Espectrofotometría y Espectro de Absorción

LABORATORIO N°1: ESPECTROFOTOMETRÍA Y ESPECTRO DE ABSORCIÓN.

• Espectrofotometría: Método instrumental analítico que permite cuantificar y caracterizar un compuesto en solución.

Se fundamenta en las propiedades de átomos y moléculas de absorber y emitir energía dentro del espectro electromagnético, en los rangos de Luz UV, Luz Visible y Luz Infrarroja.  (Se propaga en forma de onda).

• La luz visible excita la retina y produce el fenómeno de la “visión” (colores).
• Longitud de Onda (l): Distancia que se produce entre 2 máximos o mínimos de una onda propagada.
• Luz UV: 200 a 400nm.  • Luz Visible: 400 a 700nm.  • Luz IR: 700 a 30000nm.
• Fenómenos de interacción materia-radiación electromagnética: Reflexión, Refracción, Absorción, Interferencia, Difracción, Polarización e Ionización.
• Los métodos espectrofotométricos de análisis se basan en el fenómeno de absorción.
• Principios y Leyes de la Fotometría:
• La intensidad de la luz transmitida l_t (luz que atraviesa o sale del medio) es siempre menor que la intensidad de la luz incidente l_o  (luz que llega al medio)
• Lambert (1760)(placas de vidrio). A medida que el espesor del medio transparente (l) aumentaba aritméticamente (1,2,3,4…), la intensidad de la luz transmitida disminuía geométricamente (16,8,4,2…).  La intensidad de la luz transmitida(I_t) = Producto entre la intensidad de la luz incidente (l_o) y la potencia en base 10 con exponente negativo (-el). e= Constante propia del medio transparente (coeficiente de extinción) y l el espesor del medio. L_t = l_o x 10 ^{–e L}
• Beer (1852). Para estudiar la absorción de la luz, aplicó estos principios a soluciones coloreadas de diferentes concentraciones, encontrando la misma relación: L_t = l_o x 10 ^{–e C}
• Combinando ambas ecuaciones se obtiene la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la disminución de la intensidad de la luz transmitida con la concentración y el espesor o largo de una solución: L_t = l_o x 10 ^{–e l  C}
• Esta Ley se cumple rigurosamente en una radiación monocromática. L_t / l_o = 10 ^{–e l C}

• La razón l_t / l_o se llama Transmisión o Transparencia del sistema.
• Cuando la luz transmitida es = a la luz incidente, esta razón es = a 1,0 lo que significa que el sistema es Transparente
• Transmitancia: Es la transparencia del soluto disuelto que se desea medir              
• Opacidad:Valor recíproco de la transmisión o transparencia: l_o / l_t log  l_o / l_t  = e/ c

El logaritmo de la opacidad se denomina Absorbancia o Extinción (Actualmente Densidad Óptica [DO] o Absorbancia [A]:  DO = A = e/c

• La absorbancia es directamente proporcional al espesor (l) y a la concentración  (c) de una solución y, depende de una constante e  (coeficiente de extinción) que es característica de cada sustancia, a una longitud de onda y solvente determinados.
• El valor de e de una sustancia se puede determinar experimentalmente haciendo que el producto de la concentración de la sustancia y el espesor, o trayecto atravesado por la luz, sean iguales a 1,0(l x c =1). En ese caso, el valor de la absorbancia de la solución es igual al valor de e.
• El valor numérico de este coeficiente es generalmente en centímetro (cm).
• La concentración se expresa en molar (moles por litro). Si se mide o se calcula la absorción de una solución 1 M de una sustancia, colocada en una cubeta  de 1 cm, se obtiene el coeficiente de extinción molar. Cuando la concentración se expresa en gramos por litro se obtiene el coeficiente de extinción específico.
• Los valores de estos coeficientes, son dependientes del solvente, de la longitud de onda y temperatura, y corresponden a una propiedad específica de la molécula del soluto.
• Espectros de Absorción: Es la curva de Absorbancia v/s Longitud de onda.
• El espectro puede presentar  1 o más máximos de absorción, lo que permite identificar la longitud de onda a la que el compuesto presenta máxima absorbancia. La mayoría la presenta en el rango de luz visible (400-700nm).
• Los compuestos incoloros pueden poseer máximos de absorbancia en rango UV (200-400nm). Ej. Proteínas/Ac. Nuc

• El color de los cuerpos se debe a la recepción de las radiaciones que no han sido absorbidas, al hacerles incidir luz blanca artificial o natural (solar), es decir, son reflejadas.
• La longitud de onda que absorbe una sustancia, es el color suplementario al que la sustancia tiene.

*Azul (450-500nm) *Naranja (590-620nm)->

*Amarillo (570-590) *Violeta (400-450nm)->

* Rojo (620-760nm) *Verde (500-570nm)->

• Si queremos medir la concentración de una sustancia en solución  (Relación concentración-absorbancia) (Ley de Lambert-Beer) debemos elegir aquella luz (color de la luz o longitud de onda equivalente) que es absorbida con mayor intensidad por la sustancia en  solución.
• Fotocolorimétricos: Instrumentos diseñados para seleccionar el color de la luz útil para la medición que se desee.
• Filtros coloreados: Se interponen entre la fuente luminosa y la solución a medir. Además de su color, pueden identificarse por su longitud de onda a la cual son transparentes (Rojo:640 Naranja:600 Amarillo:590 Verde:540 Azul:470 Violeta:420).
• Otros modelos de fotómetros poseen un monocromador interno que “disca” la long. Onda que se desea obtener.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

• Tubo Compuesto o pigmento en solución
• Tubo Solvente de la solución à Utilizado como blanco para calibrar el fotómetro en cada medición. (100%Trans)
• Determinar  la ABSORBANCIA de un compuesto a diferente long. de onda: Cada 25, desde 400 a 700nm.(Barrido)
• En función del espectro (curva) obtenida, se repetirán las mediciones de longitud de onda en los rangos donde se tuvo mayor absorbancia (Cada 5nm.) (Confirmación).
• Graficar e identificar las longitudes de ondas, a las cuales el compuesto presenta máximos y mínimos.
• Indicar a qué long. De onda realizaría el análisis cuantitativo del compuesto.  Identificar compuesto.

LABORATORIO N°2: CURVA DE CALIBRACIÓN.

• Para determinar experimentalmente la concentración de una sustancia en solución, es necesario que posea una longitud de onda de máxima absorbancia.
• Si la sustancia no es coloreada (no absorbe luz visible), es necesario aplicar un procedimiento o reacción química que genere un compuesto con un máximo de absorbancia en el rango visible, o bien utilizar otro rango del espectro electromagnético.
• Para medir la concentración en un fotocolorímetro es indispensable mantener constante el espesor o largo (l) de la solución. Para esto se usan cubetas o tubos de fotómetro.  Concentración: C = A / K
• El valor de la absorbancia (A) de la solución queda determinada por el valor de dos constantes (e y l) y por la concentración (c) del soluto absorbente en solución. El producto de las dos constantes es  K o factor de calibración (constante específica para cada sustancia y se puede calcular con una curva de calibración) A = K x C
• Curva de Calibración: Se prepara midiendo la absorbancia de una serie de Soluciones Patrones y luego se grafica Absorbancia (A) v/s Concentración (C). Para diseñar una curva de calibración, además de soluciones patrones crecientes, necesita un Blanco colorimétrico.
• Soluciones Patrones: Soluciones de concentraciones exactamente conocidas de la sustancia en estudio.
• Solución Blanco: Solución que contiene todos los reactivos necesarios para que proceda la reacción, excepto el compuesto en estudio. El gráfico permite:
• Determinar los límites de concentración, según Ley de Lambert-Beer (linealidad entre (A) y (C).
• Obtener el valor de K mediante el cálculo de la pendiente de la recta, o.
• Calcular el valor de K para cada punto de la recta (K=A/c), y luego obtener el valor promedio o K promedio.
• Conocido el K, la Conc desconocida puede ser determinada después de medir la absorbancia de la solución problema, interpolando valor de absorbancia en la gráfica o aplicando la ecuación: C= A/K
• Los métodos de Biuret y Folin-Lowry para determinación de proteínas, los métodos de Somogyi-Nelson y del 3,5-dinitrosalicilato para azúcares reductores.

Objetivos del Lab:

• Preparar curva de calibración para determinación de proteínas por el Método de Biuret.
• Aplicar técnicas respectivas y conocer las bases químicas de la técnica fotométrica aplicada.
• Graficar Absorbancia v/s Concentración
• Determinar el Factor de Calibración mediante procedimiento gráfico y numérico.

Existen diversos medios analíticos de determinación de concentración de proteínas en solución, en función de:

• Concentración de proteínas de la muestra problema.
• Cantidad de muestra disponible.
• Si se desea recuperar o no la muestra.

 Método de Biuret:

• En soluciones alcalinas fuertes, el Biuret reacciona con el Sulfato de Cobre (CuSo₄) dando un compuesto de “color violeta” (Reacción de Biuret).
• Esta reacción es muy general, ya que la dan positiva todos los compúestos que se asemejan estructuralmente al compuesto Biuret, en particular las proteínas, que a través de sus enlaces peptídicos, forman un complejo organometálico entre el Ión cúprico y el grupo NH del enlace peptídico.
• Los dipéptidos y los AA (con excepción de Histidina, Serina y Treonina) no forman Complejos coloreados.
• Los iones Amonio y la Urea interfieren en la reacción dando “falsos positivos”.
• En las muestras biológicas, no hay otras sustancias, fuera de las proteínas, que den positiva la reacción de Biuret, por lo que este método se puede utilizar para la determinación de proteínas en solución, entre los límites de concentración de 50mg% a 1.000mg%, en la solución problema.

Reactivos:

• Reactivo de Biuret (Sulfato de Cobre; Tartrato de Sodio y Potasio; Hidróxido de Sodio). **La adición de 0,1% de yoduro de potasio puede prevenir la excesiva reducción y no interfiere con el color del reactivo**.
• Solución estándar de proteínas al 1% p/v.
• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MÉTODO DE BIURET.
• Se prepara una batería de tubos que incluyen: Blanco fotométrico y los Tubos patrones que contienen alícuotas de la solución patrón, además del tubo con la Muestra Problema, en la que se determinará la Conc. de proteínas.

• Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C. Leer la Absorbancia a 540nm.
• Tabular resultados: Tubo/Absorbancia/Abs.corregida/Mg. Proteínas por tubo (1gBSA en 100ml=XgBSA en 1ml.) à (1mlBSA en 10mgProt.=0,2mlBSA hay XmgProt.) / Factor de calibración(de cada tubo, excepto MP) K=A/C.
• Graficar Curva (A₅₄₀ v/s mg.Prot./tubo).
• Determinar K en gráfica y matemático (promedio de todos los tubos, excepto MP).
• Determinar Concentración de Prot. en la MP (C=A/K) Unidad: mgProt./ml

LABORATORIO N°3: ENZIMOLOGÍA EXPERIMENTAL.

• Velocidad de la reacción enzimática: En función de la cantidad de desaparición del sustrato o de la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.
• Depende de la cantidad de enzima activa presente en la reacción.
• Cuando la Conc. De sustrato es saturante, toda la enzima está formando el Complejo enzima-sustrato y la Velocidad de la reacción es Máxima y directamente proporcional a la Conc. total de enzima presente en el medio.
• Para determinar las velocidades de las rx. catalizadas por las enzimas, es necesario conocer el o los sustratos y el o los productos de dichas reacciones y disponer de los métodos analíticos para su cuantificación.
• Es necesario comprobar que el método fotométrico utilizado para  medir la concentración de sustrato (o producto) de la reacción enzimática, obedece la ley de Lambert-Beer a la concentración  del sustrato o del producto analizado. Para lo cual necesitamos una curva de calibración para el método de medición.
• Es necesario disponer de una curva de progreso que permita establecer el tiempo de incubación en el que la formación de producto es proporcional al tiempo de incubación y la concentración de enzima que genere la cantidad de producto, que esté dentro de los límites de detección del método fotométrico seleccionado.
• Controles: Para descartar resultados que sean consecuencia de artefactos experimentales que puedan simular una actividad enzimática y alterar las determinaciones cuantitativas de concentraciones de productos o sustratos.

Blanco Sustrato: Contiene todos los componentes del ensayo enzimático, pero el volumen de sustrato se reemplaza  por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite al terminar el ensayo, cuantificar el producto originalmente presente en la preparación enzimática y/o el producto formado.

Blanco Enzima: Contiene todos los  componentes del ensayo enzimático, pero el volumen de enzima se reemplaza por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite al terminar el ensayo, cuantificar el producto formado no-enzimáticamente, debido a la inestabilidad química del sustrato.

Tiempo Cero: Contiene todos los componentes del ensayo enzimático, pero la reacción enzimática se detiene en el momento mismo de completar la adición de los componentes, agregando el agente inactivador. Este control permite cuantificar el producto presente al inicio del ensayo y, así acusar interferencias debidas a cualquiera de los componentes de la mezcla.

• A concentración constante de enzima, el efecto del aumento de la concentración de sustrato sobre la velocidad enzimática, se establece por la ecuación de Michaelis-Menten (Hipérbola rectangular asintótica)
• Para ensayar o evaluar una enzima, elegir una concentración de sutrato que permita que la reacción sea de orden 0 (Velocidad que es independiente de la concentración de sustrato usado). Esto se consigue realizando el ensayo a una concentración 10 o 100 veces mayor que la K_m y su V_max
• La velocidad de una reacción enzimática es influenciada por múltiples factores, por ej. pH, temperatura, Concentración de sustrato y presencia de inhibidores.

pH: Debe mantenerse constante durante la incubación (mediante amortiguador o tampón adecuado), ya que la velocidad de una reacción enzimática está influenciada por el pH del medio de la incubación. Los residuos de AA que participan en la catálisis presentan diferentes grados de ionización a diferentes pH del medio de incubación, por lo que la mayor velocidad alcanzada por la enzima será cuando se incube a su pH óptimo.

Temperatura: Modifica la velocidad de la reacción enzimática, por lo que debe mantenerse constante durante la reacción (EJ. Baños termorregulados). A medida que la t° de incubación aumenta, la actividad de la enzima aumenta, hasta alcanzar la t° óptima experimental. A temperaturas superiores, la desnaturalización se evidencia más, hasta producirse una total inactivación de la enzima.  El tiempo de incubación es una variable que influye en dicha elección, lo habitual es que sea entre 20° y 45°C. La T° influye además sobre la estabilidad de la enzima, que es más alta mientras más baja sea la t°.

• Si se grafica la cantidad de producto formado en función del tiempo, se obtiene la curva de progreso de la reacción.

• A medida que el sustrato  se consume en el tiempo, la curva se va aplanando debido a: I)La reacción ha alcanzado el equilibrio, II)La enzima tiende a denaturarse en el tiempo, III)La concentración de producto alcanzó un nivel inhibitorio para la enzima.
• Unidades de expresión de la actividad enzimática.

 Velocidad de reacción: cantidad de producto formado , o bien

Unidad de tiempo

 Velocidad de reacción: cantidad de sustrato desaparecido

Unidad de tiempo

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA.

El ensayo enzimático se incubará a 5 valores de pH distintos, utilizando amortiguadores de citrato para el rango de pH 3 – 6 y amortiguador TRIS para rangos de pH 7 -9. Para cada situación de pH se prepararan 2 tubos: un blanco enzima y ensayo completo. Una vez que todos los tubos (blancos y ensayos completos) contengan la mezcla de amortiguador, sustrato y agua correspondientes, serán pre-incubados por 2 minutos a 45ºC, de igual modo –con el mismo fin- colocara en el baño termoregulado el tubo que contiene la enzima sola por el mismo tiempo. Transcurrido el tiempo de pre-incubación, procederá a adicionar la alícuota de enzima de acuerdo al protocolo a los tubos que corresponda iniciando la reacción.

La reacción se realizará a 45ºC. durante 10 minutos y se detendrá adicionando NaOH 0,4 M.

  *EL BLANCO COLORIMETRICO NO SE INCUBA.

• Factor de calibración: 3,9 (micro moles p-nitrofenol/tubo)^-1
• Expresión de resultados

1.   Hacer tabla con los resultados obtenidos. Anotar absorbancias.

2.   Determinar el pH óptimo de la enzima (Sacar promedios de absorbancias)

3.   Sacar concentración: C=A/K(3.9) (C= MmolPNP/tubo)/10= Velocidad (MmolPNP/minuto).

4.   Determinar el rango de pHs a los que la actividad de la enzima alcanza un 90%, 80% y 70% de actividad.