Cromatografía

Método físico de separación de componentes en una mezcla

• Los componentes se distribuyen en dos fases

Fase Estacionaria

• Permanece estática
• Puede ser sólida, gel o líquida
• Sólida: Interacción de los solutos en la superficie
• Líquida: Ligada químicamente a un soporte sólido

Fase Móvil

• Se mueve a través de la fase estacionaria
• Puede ser líquida o gaseosa
• Función: Transporta la mezcla de solutos disueltos

Según el Estado de la Fase Móvil

Cromatografía Líquida

1. Fase móvil es un líquido
2. Solutos disueltos (solución homogénea)

Cromatografía Gaseosa

1. Fase móvil es un gas
2. Solutos son gaseosos o volátiles

Según el Soporte de la Fase Estacionaria

• Cromatografía en columna: La fase estacionaria se aloja en un tubo de acero, vidrio o plástico
• Cromatografía en capa fina: La fase estacionaria recubre una superficie planar, por ejemplo, vidrio o metal (aluminio)
• Cromatografía en papel: El papel hace de soporte y fase estacionaria a la vez

Principio de Separación de Componentes en la Cromatografía

• El soluto interactúa tanto con la fase estacionaria como con la fase móvil de acuerdo a sus propiedades físicas y químicas
• El grado de interacción con ambas fases por parte del soluto tendrá un reparto específico por el sistema
• Un grupo de solutos en una mezcla pueden ser separados efectivamente aprovechando pequeñas diferencias entre ellos

Principios de Separación Más Usados en Cromatografía Líquida

Según el tipo de interacción entre el soluto y las fases estacionaria y móvil, el reparto puede producirse por:

1. Solubilidad: Del soluto en ambas fases. El soluto presenta mayor solubilidad por una fase que por otra
2. Adsorción Química: Del soluto sobre la superficie de la fase estacionaria o se disuelve en la fase móvil
3. Carga Eléctrica: Del soluto interactúa con las cargas de la fase estacionaria y con las cargas de la fase móvil. ^{* Interacción carga-carga}
4. Exclusión e Inclusión: De moléculas de soluto en la fase estacionaria de acuerdo a su tamaño. En este caso, la fase estacionaria es un gel que presenta intersticios de un tamaño determinado en donde pueden o no ingresar los solutos de acuerdo a su tamaño
5. Afinidad Química Específica: Entre el soluto y la fase estacionaria modificada químicamente con grupos reactivos, por ejemplo, reacción antígeno – anticuerpo

1. Cromatografía de Adsorción: Soluto adsorbido en la superficie de la fase estacionaria
2. Cromatografía de Reparto: Soluto disuelto en la fase líquida que recubre la superficie del soporte líquido
3. Cromatografía de Intercambio Iónico: Aniones móviles contenidos cerca de los cationes unidos covalentemente a la fase estacionaria
4. Cromatografía de Exclusión Molecular: Las moléculas grandes son excluidas, las moléculas pequeñas penetran en los poros de las partículas
5. Cromatografía de Afinidad: Un tipo de molécula en una mezcla compleja se asocia a la molécula que está unida covalentemente a la fase estacionaria. Todas las demás moléculas pasan directamente

Terminología Cromatográfica: Etapas de la Cromatografía

1. Elección del principio de separación
2. Selección de la fase móvil, fase estacionaria y detector
3. Inyección de la muestra (solutos en la muestra) en el sistema cromatográfico
4. Separación de los solutos en la fase estacionaria o fase móvil
5. Detección de solutos separados: Los que tienen menos afinidad por la fase estacionaria salen primero
6. Interpretación de resultados

I. Siembra o Inyección

1. La muestra líquida (agua, fluidos, cabello disuelto) se incorpora en la fase móvil – fase estacionaria. Se siembra en unidades de volumen (ml, μL), 10-200 μL
2. Cromatografía preparativa: Se inyectan volúmenes grandes
3. Cromatografía analítica: Se inyectan volúmenes pequeños
4. OBJETIVO: Separar para determinar cualitativa y cuantitativamente

Cromatografía líquida

1. Fase móvil
2. Bomba impulsora de fase móvil
3. Inyector de muestra
4. Columna de separación (cerrada)
5. Detector

II. Separación «Elusión»

1. Proceso que consiste en pasar la fase móvil (líquida o gas) a lo largo de la fase estacionaria (aquí se produce la separación)
2. Su fin es arrastrar los solutos a través de la columna y finalmente sacarlos de ella
3. El consumo de fase móvil es bajo: 1 ml/min (volumen/tiempo)
4. La elución se puede realizar usando un solvente o una mezcla de solventes miscibles que permita la separación óptima de los solutos
5. Muy importante es su capacidad de elución de la fase móvil, que son: a) Composición química, b) pH, c) Flujo

Forma de Elusión Según el Tipo de Cromatografía

1. Cromatografía en capa fina: La elución por impregnación de la fase móvil en la fase estacionaria
2. Cromatografía en columna abierta: La elución se produce por descenso de la fase móvil a través de la fase estacionaria simplemente por gravedad
3. Cromatografía en columna cerrada: La elución se produce al ser la fase móvil impulsada mediante una bomba a través de la fase estacionaria

III. Detección

Consiste en la demostración de la presencia del soluto en el eluido mediante una evidencia física, por ejemplo, color.

Analitos:

1. Adsorción molecular (UV-Vis): Adsorción de radiación electromagnética
2. Conductividad eléctrica: Carga eléctrica
3. Fluorescencia molecular: Fluorescencia
4. Índice de refracción

Los detectores más comunes usados en cromatografía líquida son:

1. Detector ultravioleta – visible: Detecta compuestos coloreados o que absorben luz en el rango ultravioleta o rango visible del espectro
2. Detector de fluorescencia: Detecta compuestos fluorescentes
3. Detector refractométrico: Mide el índice de refracción de los compuestos, que es una característica específica de cada compuesto, por ejemplo, en la identificación de azúcares
4. Detector de conductividad: Detecta compuestos con carga eléctrica o conductores

Características Fundamentales de un Sistema de Detección

Sensibilidad: Respuesta de un detector a una cantidad dada de analito. La sensibilidad es una medida relativa que depende de las condiciones de medida.
Límite de detección: Concentración mínima de un analito que puede ser determinada por un detector.
Según IUPAC, corresponde a 3 veces la desviación estándar de los valores de 30 determinaciones del blanco, donde la concentración del analito es cero.
Selectividad: Capacidad de un detector o un reactivo de responder a la presencia de un soluto o un tipo de solutos específicos.
Rango lineal: Rango de concentración de un analito donde la respuesta del detector es proporcional a una variación de la concentración (normalmente incrementos de 5%).

Cromatograma

Un cromatograma es la presentación gráfica de los compuestos después que éstos han sido separados en la fase estacionaria y el proceso de elución ha sido terminado.

Tipos de Cromatogramas

1. Cromatografía Planar

• El cromatograma estará dado por los compuestos separados en función de la distancia recorrida en la fase estacionaria por cada uno de ellos
• Este tipo de cromatogramas o revelados son típicos de la cromatografía en capa fina o en papel, donde el cromatograma será evidenciado después de aplicar un reactivo colorante
• El reactivo revelador reacciona con todos los solutos separados y forma productos coloreados sobre la fase estacionaria claramente distinguibles sobre la placa o papel

2. Cromatografía en Columna

• Los compuestos que salen de la columna son detectados en el líquido eluido
• El detector del sistema se encuentra a la salida de la columna y genera una señal o respuesta en función a la concentración de cada soluto detectado en el líquido eluido
• Como tiempo inicial (t₀), se considera al momento de la introducción de la muestra al sistema cromatográfico y se termina cuando se eluye el último compuesto separado desde la columna
• Al terminar el proceso de elución, el resultado gráfico de la salida de los compuestos separados es el cromatograma, donde se representa: respuesta o señal del detector vs. tiempo de elución
• Obviamente, el soluto que presenta menor afinidad por la fase estacionaria avanzará más rápido y saldrá primero de la columna, siendo éste el primero en ser detectado por el detector