Métodos Cromatográficos

La cromatografía es una poderosa técnica de separación que separa un soluto o una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos. Esto se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquido, gas o fluido supercrítico) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida.

El nombre proviene de la primera experiencia cromatográfica realizada, utilizada para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo.

Clasificación de Métodos Cromatográficos

1. Tipos de Cromatografía

Basados en el fundamento del proceso cromatográfico.

2. Técnicas Cromatográficas

Basadas en la forma del proceso cromatográfico.

Tipos de Cromatografía

Si la fase estacionaria es un sólido, tenemos:

• Cromatografía de Adsorción: El sólido absorbe el componente que inicialmente estaba en fase móvil (líquida o gaseosa) (fuerzas de Van der Waals).
• Cromatografía de Intercambio Iónico: El sólido es un cambiador de iones (fuerzas electrostáticas).
• Cromatografía de Exclusión (o de Geles): El sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.
• Cromatografía de Afinidad: Es un tipo especial de cromatografía de adsorción, utilizada especialmente en bioquímica, en la que un sólido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad (ej. un indicador enzimático o un anticuerpo).

Si la fase estacionaria es un líquido que se encuentra soportado en un sólido inerte:

• Cromatografía de Partición o de Reparto: El soluto se reparte entre la fase móvil (líquido o gas) y la fase estacionaria.

Según la naturaleza de la fase móvil:

Si es un líquido: Cromatografía Líquida

• Líquido-Líquido (CLL): Ambas fases son líquidas (cromatografía de partición).
• Líquido-Sólido (CLS): La fase estacionaria es sólida (adsorción, intercambio iónico, exclusión, afinidad).

Si es un gas: Cromatografía de Gases

• Gas-Líquido (CGL): Cromatografía de partición.
• Gas-Sólido (CGS): Cromatografía de adsorción.

Si es un fluido supercrítico (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura crítica, pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión crítica), se trata de la Cromatografía de Fluidos Supercríticos (CFS), que puede ser de partición o de adsorción.

Técnicas Cromatográficas

Según cómo se lleva a cabo la separación cromatográfica, es decir, según el dispositivo utilizado para llevar a cabo el proceso entre la fase móvil y la estacionaria, se tienen dos tipos de técnicas cromatográficas:

Cromatografía Plana

La fase estacionaria está colocada en una superficie plana y se divide en dos tipos generales:

• Cromatografía en Papel: El papel actúa como soporte de la fase estacionaria (cromatografía de partición).
• Cromatografía en Capa Fina (CCF): Un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografía de adsorción), extendido en una capa delgada sobre una placa.

Cromatografía en Columna

Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a través de ella se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue por:

1. Presión
2. Capilaridad
3. Gravedad

Y son:

1. En columna abierta
2. De gases
3. Líquida (HPLC)

Cromatografía Plana

Parámetros que definen la eficacia de la separación: razón de frente (Rf) = dist. soluto / dist. solvente, y resolución (Rs). Los factores que influyen en la eficacia de la separación:

• Las fases móviles y estacionarias
• Tipo de cámara de desarrollo y su saturación
• Tamaño de las manchas aplicadas
• La temperatura y la humedad
• El espesor de la capa en CCF
• Las impurezas presentes en la muestra

Cromatografía en Papel

Apareció en 1940 (Martin y Synge). La fase móvil es un solvente mixto (neutro, ácido o básico). Mezclas usadas: isopropanol-amoniaco-agua, n-butanol-ácido acético-agua y fenol acuoso.

Procedimiento de Desarrollo

• Modo ascendente: La muestra se siembra en un extremo del papel y el desarrollo se realiza hacia arriba.
• Modo descendente: Se realiza aprovechando la fuerza de gravedad, colocando la muestra en la parte superior de una cámara.
• Modo radial: Se realiza en un papel filtro circular; la muestra se aplica en el centro. El movimiento radial del solvente produce anillos concéntricos (más para efectos didácticos).

Equipo

Cámara de desarrollo, papel filtro Whatman, capilares, aspersor, reveladores no corrosivos. El cromatograma en papel puede ser un documento de la prueba realizada.

Aplicaciones

Muy pocas en la actualidad, especialmente en el área de bioquímica.

Cromatografía en Capa Fina (CCF)

Es rápida, versátil y sensible. Es una cromatografía líquido-sólido y la adsorción es el mecanismo más empleado. El adsorbente se difunde en una capa fina sobre una capa de vidrio (Stahl). La alúmina o gel de sílice son los adsorbentes más útiles; puede incorporarse un agente ligante (sulfato de Ca). El tamaño de la partícula de la fase estacionaria o adsorbente es más pequeño que el de los materiales de columna, indicando mayor sensibilidad.

Aplicaciones

La principal aplicación consiste en detectar e identificar compuestos en muestras complejas. Tiene aplicación en bioquímica y farmacia (sustancias inorgánicas y orgánicas): tintas y colorantes, hidratos de carbono, proteínas, aminoácidos, vitaminas, minerales, medicamentos, tóxicos y venenos, lípidos y hormonas, etc.

Cromatografía Preparativa

Técnica de purificación y separación, útil para aislar componentes de una mezcla. Una placa analítica tiene un espesor de 100 a 250 µm, mientras que la placa preparativa tiene un grosor de 0,5 a 2 mm (10 a 100 mg de material).

Cromatografía de Alta Eficacia en Capa Delgada (HPTLC)

Ventajas

• Mejor calidad del material adsorbente.
• Mejor eficacia separativa.
• Reducido consumo de fase móvil y volumen de muestra.
• Gran rapidez en el desarrollo cromatográfico (3 a 30 min).
• Mayor sensibilidad, selectividad y reproducibilidad.
• Varias posibilidades de desarrollo cromatográfico (aplicación de presión al flujo de fase móvil o HPTLC circular).

Cromatografía en Columna

Se divide en: cromatografía en columna abierta (CC), cromatografía en fase gaseosa, cromatografía líquida.

Cromatografía en Columna Abierta (CC)

Proceso lento y poco eficaz. Es una técnica laboriosa que no proporciona directamente la composición de las fracciones. Solo se pueden separar muestras de orden de gramos a mg. Se utiliza para separar y purificar diversas muestras.

Parámetros que Intervienen en la Separación

Volumen de retención (Vr) o tiempo de retención (Tr), coeficiente de reparto (K) y razón de reparto (k). Si al final se le coloca un detector sensible a los analitos y se registra su señal en función del tiempo, se obtiene una serie de picos gaussianos. Este gráfico se llama cromatograma.

Teoría de la Cromatografía (Teoría Cinética o Dinámica)

(Van Deemter, 1956). La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendrá dada por dos factores:

1. La diferencia de velocidades de migración de solutos que origina la separación física entre picos.
2. La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teórico, que traerá consigo ensanchamiento.

Separación de la Mezcla

1. Modalidad isocrática: Condiciones experimentales constantes (composición constante de la fase móvil, equivalente a temperatura constante en cromatografía de gases).
2. Modalidad no isocrática: Variación gradual durante el proceso cromatográfico. Dos parámetros fundamentales: la composición de la fase móvil y la temperatura de la columna (representada con Φ).

Valores altos de Φ favorecen el paso de los solutos a la fase móvil, obteniendo un cromatograma con picos fuertemente solapados (factor de retención bajo). Valores bajos de Φ dan lugar a solutos bien separados, pero los solutos fuertemente retenidos dan picos achatados y mal definidos.

Cromatografía de Gases

Técnica en la que la muestra se volatiliza e inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte que no interacciona con las moléculas del analito; solo las transporta a través de la columna. Se divide en:

• Cromatografía gas-sólido (GSC): Fase estacionaria sólida; la retención se produce mediante adsorción. Su única aplicación son especies gaseosas de bajo peso molecular.
• Cromatografía gas-líquido (GLC): Utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre una superficie de un sólido inerte.

Instrumentación

Gas Portador

Cumple dos propósitos: transportar los componentes de la muestra y crear una matriz adecuada para el detector. Debe ser inerte, minimizar la difusión gaseosa, estar fácilmente disponible y ser puro, económico y adecuado al detector a utilizar (pureza de 4.5 o mayor, 99.995%). Generalmente se emplea helio, argón, nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono.

Reguladores de Presión

Se utilizan para regular el flujo (dos niveles: uno a la salida de la bombona y otro en la entrada del cromatógrafo; presiones entre 10 y 25 psi).

Inyección de la Muestra

Punto crítico; se debe inyectar una cantidad adecuada (método más utilizado: microlitro jeringa).

Columna

Lugar donde ocurre la separación. Materiales: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio y teflón. El relleno puede ser un sólido o un líquido. Se clasifican según el propósito: empacadas (analíticas y preparativas) y capilares (WCOT, SCOT).

Factores que Afectan la Eficacia de una Columna

• Longitud de la columna
• Diámetro de la columna
• Tamaño de las partículas de relleno
• Naturaleza de las fases
• Cantidad de fase estacionaria
• Temperatura de la columna
• Velocidad del gas portador
• Cantidad de muestra inyectada
• Material de la columna
• Enrollado de la columna

Detector

Características: altamente sensible a bajas concentraciones de soluto, universal, alto rango de linealidad en la respuesta.

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)

Su campo de aplicación cubre una gran cantidad de sustancias orgánicas e inorgánicas, incluyendo compuestos termosensibles o con polaridad elevada que no pueden ser analizados adecuadamente por GC. La diferencia entre HPLC y GC se encuentra en el tipo de detectores y en la influencia de la fase móvil. En GC es sencillo encontrar detectores que diferencien la muestra de la fase móvil (gas inerte). Esto no es simple en HPLC, ya que la fase móvil no solo es inerte sino que su masa es sensiblemente superior. Por eso, cualquier dispositivo que mida una propiedad física del soluto (conductividad térmica, ionización en una llama, captura de electrones, etc.) es apropiado en GC y no en HPLC. Otra diferencia se refiere a la influencia de la fase móvil en la separación: en gases la fase móvil es un simple portador del soluto y prácticamente no influye en la separación; por el contrario, en HPLC la fase móvil es el parámetro fundamental que gobierna la separación.

Electroforesis

Método analítico de separación que consiste en separar biomoléculas cargadas (+ o -) en un campo eléctrico (ánodo y cátodo). La mezcla compleja se mueve hacia uno u otro electrodo considerando v = m * E. Se pueden separar compuestos con grupos ionizables y biomoléculas como proteínas (aa.), péptidos, ácidos nucleicos, lípidos y metales. Hay dos tipos: convencional y capilar.

Instrumentación

Fuente de alimentación, soporte para las tiras de acetato de celulosa, cubeta de corrida, aplicador, puente, reactivos (tampones, revelador, decolorantes y transparentizador), densitómetro.

Electroforesis Capilar de Alta Eficacia

Técnica analítica que separa componentes de una mezcla basándose en la distinta movilidad que experimentan las especies iónicas cuando son sometidas a un campo eléctrico muy intenso (300-400 V/cm) en el interior del tubo capilar.

Factores que Afectan el Movimiento de los Iones

• Carga de la partícula o ion
• Campo eléctrico aplicado
• Fuerza electroforética
• Coeficiente de fricción
• Masa del ion esférico
• Viscosidad del medio
• Tamaño y forma de las partículas

Parámetros que Influyen en la Movilidad

1. Campo eléctrico
2. Temperatura (favorece la desnaturalización de ciertas sustancias)

Parámetros Relacionados con el Solvente y el Sistema Electroforético

1. Constante dieléctrica
2. Viscosidad
3. Fuerza iónica
4. Naturaleza de los iones
5. pH
6. Grado de disociación
7. Carga neta
8. Necesidad de tamponar

La electroforesis se divide en zonal y capilar. La zonal se divide en: electroforesis en papel, electroforesis en acetato de celulosa, electroforesis sobre geles e inmunoelectroforesis.

Equipo

Cámara o cubeta electroforética, fuente de poder, detector o densitómetro.

Métodos de Detección en Electroforesis

Métodos ópticos (por absorción en UV), métodos radioquímicos, métodos de ensayo biológico.