Conceptos Básicos

• Absorción: Retención de una especie química por parte de una masa. Depende de la tendencia que tiene esta a formar mezclas o a reaccionar químicamente con la misma.
• Adsorbente: Fase estacionaria en la cromatografía de adsorción y de reparto.
• Adsorción: Retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Esta retención superficial puede ser física o química.
• Cromatografía en fase inversa: Cromatografía con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.
• Cromatografía en fase normal: Cromatografía con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.
• Disolvente o revelador: Fase móvil.
• Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
• Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna.
• Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra. Posee una gran área superficial y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.
• Fase móvil: Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y la fase estacionaria.
• Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía.
• Soporte: El material sólido inerte que en la cromatografía de reparto sirve para sostener la fase estacionaria líquida en su sitio.
• Sorbente: Fase estacionaria.
• Cromatograma: Además de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las medidas continuamente para obtener una información global del proceso pasando la muestra a través de un detector instrumental. Normalmente, los transductores del detector se sitúan al final de la columna. El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del eluyente que pasa por él. Estos cambios son reproducidos y registrados en forma de gráfica. Esta gráfica que recoge la respuesta del detector en función del tiempo se denomina cromatograma.

Tipos de Cromatografía

Cromatografía en Papel

Es una forma combinada de cromatografías de partición y adsorción en la que la fase estacionaria es el agua absorbida presente en el papel, y el soporte es el papel mismo.

Cromatografía de Capa Fina (TLC)

En la TLC el eluyente (fase móvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción.

Cromatografía en Columna

Fue la forma original de cromatografía líquida realizada por primera vez en 1906 por Tswett. La fase estacionaria normalmente se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque que van desde la alúmina, gel de sílice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintéticas y derivados polisacáridos. Se usan todos los tipos de cromatografía líquida. Lo habitual es que la fase móvil se deje percolar a través de la columna por gravedad. No se usa mucho en el análisis de alimentos ya que es una técnica para la separación cromatográfica de mezclas de sustancias. Sin embargo, hoy en día existe un sistema cromatográfico completo y automático diseñado para el análisis bioquímico que se conoce como “cromatografía líquida rápida para proteínas”.

Principios de la Separación Cromatográfica

En la cromatografía se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por una fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o líquida. La separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. Como resultado, hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la separación de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos según el mecanismo de separación:

• Cromatografía de reparto: Separa los solutos basándose en la solubilidad.
• Cromatografía de adsorción: Se basa en la afinidad de adsorción.
• Cromatografía de exclusión: Separa solutos según el peso molecular.
• Cromatografía de intercambio iónico: Separa solutos según la carga iónica.

También se pueden clasificar según el estado de la fase móvil en:

• Cromatografía de gases: La fase móvil es un gas y pueden ser cromatografía gas-líquido y cromatografía gas-sólido.
• Cromatografía líquida: La fase móvil es un líquido y puede ser cromatografía líquido-líquido, cromatografía líquido-sólido, cromatografía de exclusión y cromatografía de intercambio iónico.

Las únicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografía son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las técnicas cromatográficas no se incluyen los métodos que utilizan campos eléctricos para separar moléculas cargadas, métodos que se denominan electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis. El proceso cromatográfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unión de fenómenos tales como hidrodinámica, cinética, termodinámica, química de superficie y difusión. Hasta la fecha se han propuesto muchas teorías, que incluyen complejos matemáticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados a través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases. Se lleva a cabo una cromatografía líquida en fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase móvil es relativamente apolar. Se realiza una cromatografía en fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase móvil es relativamente polar.

Tipos de HPLC

• Cromatografía de reparto: Para especies poco polares pero no iónicas de masa molecular < 10⁴ g/mol.
• Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido: Para especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular < 10⁴ g/mol.
• Cromatografía de intercambio iónico: Para especies iónicas de masa molecular < 10⁴ g/mol.
• Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en geles: Para solutos con masa molecular > 10⁴ g/mol.

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condición, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase móvil un líquido. Es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada debido a sus cualidades de sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su gran adaptabilidad a sustancias que son de gran interés para la industria, la ciencia y la sociedad. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran variedad de sustancias inorgánicas.