Separaciones Analíticas

Introducción

La separación analítica consiste en dividir una muestra en al menos dos fases (inmiscibles) de composición distinta para incrementar la fracción molar del analito en una de ellas. Las ventajas son la sensibilidad y selectividad, y las desventajas son que se cometen errores y necesita mucha precisión. Los parámetros de mayor interés son:

• Coeficiente de reparto (K_D) = (A)₁/(A)₂
• Factor de separación (α) = K^*_D/K^*_D (α >> 1)
• Relación de distribución (D): relaciona las concentraciones de todas las especies del soluto entre ambas fases. D = Σ(A)₁/Σ(A)₂

Clasificación de las Técnicas de Separación

SEGÚN LAS FASES EN CONTACTO:

• Gas-Gas: difusión térmica
• Gas-líquido: Cromatografía de reparto gas-líquido y Destilación
• Gas-sólido: Cromatografía de absorción y Sublimación
• Líquido-Líquido: Cromatografía, Extracción, Electrodeposición en cátodo de Hg, Diálisis y Ultrafiltración
• Sólido-Líquido: Lixiviación, fusión por zonas, Cromatografía de absorción, Electrodeposición, Precipitación, Cristalización, Extracción en fase sólida, Fraccionamiento por campo-flujo e Intercambio iónico
• Fluido supercrítico-líquido: Cromatografía supercrítica
• Fluido supercrítico-sólido: Extracción por fluidos supercríticos

SEGÚN EL TIPO DE PROCESO:

• Diferencia de tamaño molecular: Filtración y ultrafiltración, Cromatografía de exclusión molecular, Diálisis.
• Diferencia de densidad: Centrifugación
• Solubilidad: Cromatografía (L-L, G-L) y Extracción (L-L)
• Cambio de estado: Destilación, Sublimación, Cristalización, Fusión por zonas.
• Absorción: Cromatografía (G-S, L-S)
• Interacciones eléctricas: Electroforesis
• Reacción química: Electrodeposición, Precipitación, Cambio iónico.

SEGÚN EL CONTROL DEL PROCESO:

• Termodinámico: Extracción L-L, Destilación, Sublimación, Fusión por zonas, Precipitación, Electrodeposición, Cromatografía.
• Cinético: Diálisis, Centrifugación, Electroforesis, Ultrafiltración, Cromatografía.

Separaciones Cromatográficas

La cromatografía es una técnica de separación de componentes de una muestra por distribución entre dos fases, una fase móvil (FM) y una fase estacionaria (FE). La FE puede ser sólida o líquida (soportada en un sólido o gel) y la FM puede ser G, L o fluido supercrítico. La FE está soportada sobre una superficie sólida plana o rellenando un tubo formando una columna. El eluyente es la FM, el eluato es el analito o componente de la muestra, la elución es el transporte del analito a través de la fase estacionaria y la retención es el proceso contrario a la elución.

Cromatograma: se representa la señal vs. tiempo o volumen de elución. Los componentes se distribuyen entre las fases dependiendo de su afinidad por cada una, las velocidades de desplazamiento son distintas y los componentes se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Clasificación de la Cromatografía

SEGÚN LA TÉCNICA:

• En columna: dos sustancias se separan en una columna por cromatografía de elución. La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por adición continuada de una FM. Una porción de muestra se coloca en la parte superior de la columna y los componentes se distribuyen entre las dos fases. Se introduce la FM, y la muestra avanza por la columna por gravedad o por alta presión.
• Cromatografía plana: Puede ser de capa fina (la FE es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa de vidrio, aluminio, etc. La placa cromatográfica se sumerge en un eluyente apolar. Esta placa consiste en una FE polar (sílica gel) adherida a una superficie sólida) o en papel (muy utilizado para procesos cualitativos. La FE es un papel de filtro donde en uno de sus extremos se colocan pequeñas gotas de muestra. El disolvente es empleado como FM y asciende por capilaridad).

SEGÚN EL MECANISMO DE INTERACCIÓN:

• Adsorción: la separación de los solutos depende de una serie de etapas de adsorción/desorción sobre un soporte sólido.
• De reparto: la separación de los solutos se debe a su «distribución» entre los dos fluidos que contribuyen a ambas fases.
• De intercambio iónico: separación por atracción electrostática entre analitos iónicos y grupos ionizables de carga opuesta situados en la superficie de la FE.
• Exclusión molecular: la separación de los analitos se basa en su tamaño molecular (tamizado) debido a los diferentes caminos que recorren en un gel poroso.
• Afinidad: la separación depende de las interacciones específicas entre analito y moléculas covalentemente unidas a la FE.

SEGÚN LA FASE MÓVIL: G, L o S (fluido supercrítico).

SEGÚN LA FASE ESTACIONARIA: S o L

Teoría de Platos

La columna se divide en N platos imaginarios (platos teóricos). En cada uno se produce un equilibrio de reparto (en contracorriente). Llega un volumen de FM (V_o) al plato r=0 donde tiene lugar el equilibrio de soluto entre las dos fases. El eluyente se transfiere al plato r=1 y un nuevo volumen fresco (V_o) llega al plato r=0. El proceso continúa hasta que el eluyente llega al plato r=N y sale de la columna. Cuando el soluto emerge de la columna, el detector produce una señal proporcional a la cantidad de soluto que abandona el plato r=N. Si N es grande, el pico es gaussiano. A mayor N, mayor eficacia.

Teoría Cinética

Describe el movimiento del soluto en la columna y justifica las contribuciones a la forma y ensanchamiento de la banda, influyendo sobre la eficacia de la columna.

• Difusión Eddy o mezcla por convección (Difusión de remolino): El ensanchamiento de la banda surge, en parte, a la multitud de caminos por los cuales las moléculas pueden caminar a través de la columna rellena. Es directamente proporcional al diámetro de las partículas que componen el relleno de la columna (A).
• Difusión longitudinal: el ensanchamiento de banda por la que los solutos difunden desde la zona central, donde es mayor la concentración, hacia las regiones más diluidas situadas por delante y detrás del centro de la banda, es decir, en el mismo sentido y en el opuesto al flujo de la fase móvil.
• Resistencia a la transferencia de masas: el ensanchamiento de banda por los efectos de transferencia de masa se debe a las muchas corrientes de flujo que tiene la FM en el interior de la columna. Como consecuencia de ello, se requiere un tiempo para alcanzar el equilibrio.

Resolución

Es la medida de separación entre dos picos consecutivos. Considera la selectividad (distancia entre picos) y eficacia (anchura de banda).

R_s = (t_Rb – t_Ra) / 0.5(W_a + W_b)

En un pico gaussiano el 99.7% del área de la banda se encuentra a t_R ± σ

Si W_a = W_b = 4σ, entonces R_s = (2 x 6σ) / (4σ + 4σ) = 1,5

Si R_s ≥ 1,5 (picos bien resueltos). Si R_s < 1,5 (picos solapados).

La resolución también se puede expresar en función del número de platos teóricos (N) y la selectividad (σ). Para aumentar la resolución debemos:

• Aumentar el valor de N (aumentando L, disminuyendo H, optimizando el flujo de la FM o reduciendo el tamaño de las partículas de la FE).

Aplicaciones: Análisis Cualitativo y Cuantitativo

ANÁLISIS CUALITATIVO: identifica la posición de los picos.

1. Comparación de parámetros de retención: el tiempo de retención bajo determinadas condiciones es característico de una sustancia, aunque no se tiene en cuenta el efecto matriz de la muestra o posibles interacciones con otros componentes.
2. Empleo de detectores selectivos con información cualitativa: como son las filas de diodos (LC) o espectrometría de masa (GC).
3. Formación de derivados (Precolumna o Postcolumna).

ANÁLISIS CUANTITATIVO: cuantifica la altura/área de los picos. Se basa en la comparación de la señal (altura/área del pico) del analito con la de los patrones, los cuales varían linealmente con la concentración. La medida del área se hace integrando electrónicamente la señal del pico.