Cromatografía

Método físico de separación y análisis de componentes de una mezcla. Los componentes se distribuyen de forma desigual entre la fase estacionaria y la fase móvil. Kd= analito fase A / analito b.

Objetivo: método preparativo y de análisis cuantitativo y cualitativo: PM, polaridad, PI, afinidad.

Origen: 1903, Mijail Tsvett, Extracto de hojas en lecho cromado gráfico. Se rellenó la columna con fase estacionaria (carbonato cálcico), se lavó con disolvente y se separaron los pigmentos en distintas bandas (clorofila a, B, xantofilas y Carotenoides).

Clasificación

Cromatografía en papel

Agua como fase estacionaria, forma puentes H con las fibras de celulosa. La fase móvil está formada por disolventes apolares o poco polares.

Cromatografía en capa fina (TLC)

Se recubre con una fina capa de sólido absorbente (Sílica gel o aluminio). La fase estacionaria puede ser agua o, si se mete en estufa, el absorbente. En columna.

Etapas

Aplicación de la muestra y patrones, equilibrado; desarrollo cromatográfico; revelado; análisis: RF.

Proceso

Aplicamos la muestra a 1 cm de la base. La placa se coloca dentro del disolvente que comienza a ascender por la placa y los compuestos se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil en función de sus características.

Fase estacionaria: compuestos más polares. Fase móvil: apolares.

Para observar la distribución de los componentes es necesario un revelado: Ácido sulfúrico concentrado + calor o Fluorescencia o Nihidrina (aa, amioazucares) o Vapores de yodo (lípidos).

Rf = dist analito / dist fase movil

-Rf (menor distancia recorrida, más retenida en la fase estacionaria) +polar. El mismo RF indica que pueden ser el mismo compuesto o diferentes, pero compartiendo las mismas propiedades físico-químicas y polaridad. La resolución determina cuánto se pueden separar todos los compuestos. Mezclas complejas para ganar resolución, se puede realizar dos cromatografías en una misma placa en dos direcciones para conseguir una mejor separación.

Cromatografía en columna

A mayor longitud, mayor resolución.

Términos

• Lecho cromatográfico: fase Estacionaria que se mantiene fija dentro de la columna.
• Eluyente: fase móvil que se usa para transportar los componentes de la mezcla a través de la fase estacionaria.
• Eluido/efluyente: Fluido que sale de la columna y se recoge con un colector de fracciones.
• Elusión: proceso de ir añadiendo fase móvil a la columna hasta que el compuesto sale de la columna.
• Analito: componentes individuales de la mezcla que se han de separar y analizar.
• Cromatografía: gráfica de Absorbancia frente al volumen de elusión o tiempo de retención.

Tipos

• Isocrática: la composición de la fase móvil no va a variar a lo largo del proceso de elusión.
• En gradiente: se va variando el PH, la polaridad o la fuerza iónica a lo largo del proceso.

Se analizará el influyente por absorbancia a 280 nm (0= No hay proteína en esos tubos).

Diferencias CP-CC:

• Cromatografía plana: sencilla, rápida, económica, menor cantidad de muestra, análisis cualitativo, moléculas pequeñas y varias muestras.
• Cromatografía en columna: más compleja, mayor cantidad de muestras, análisis cualitativo y cuantitativo, cualquier molécula biológica y una sola muestra.

Clasificación según el estado físico de las fases:

• Cromatografía de gases: en muestras volátiles y termoestables, deben estar en estado gaseoso. No se usa para proteínas, ya que se desnaturalizan a altas temperaturas. Método de buena resolución, la columna tiene una gran longitud. Muestras de pequeño tamaño transportados por el gas a través de la columna. Se emite la retención por un detector al final de la columna en el que puede realizarse un cromatograma.
• Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Utiliza columnas metálicas Resistentes a la alta presión, de alta resolución, por lo que se toma menos tiempo. Tienen una alta sensibilidad del orden de nanogramos o pico gramos.

Clasificación según el mecanismo de separación:

• Cromatografía de adsorción: fase Estacionaria siempre sólida. El absorbente retienen con mayor o menor fuerza el analito sobre la superficie vía interacciones débiles.
• Cromatografía de reparto: Fase estacionaria siempre líquida, el analito se reparte entre la fase estacionaria líquida y fase móvil líquida según su mayor o menor solubilidad. En fase normal, la fase estacionaria siempre será la más Polar y la móvil apolar. En fase inversa, la fase móvil será polar.
• Cromatografía de exclusión molecular: se separan componentes que difieren en su tamaño o forma, eluyen siempre los de mayor tamaño molecular primero y después los de tamaño pequeño.

Se utiliza comúnmente como fase estacionaria dextrao entrecruzado, esferas de agarosa… polímeros capaces de capturar agua. El día previo se introduce dentro de un tubo los polímeros junto a la fase móvil, se hinchan y se forma un gel. El volumen de ilusión es el volumen de fase móvil que se debe introducir en la columna. El volumen de exclusión de la columna es el volumen de la columna, para que la proteína A salga de la columna se debe añadir una cantidad igual o superior al volumen de la columna. La suma del volumen interno y el volumen de exclusión es el volumen total. El rango o intervalo de fraccionamiento representa los valores máximos o mínimos de tamaño que pueden ser disueltos en este tipo de gel. Todos aquellos compuestos que tengan tamaño entre los 100 y 5000 Da (dalton) podrán introducirse entre las esferas. Todas las que tengan un mayor tamaño que 5000 dalton van a salir a la vez, por lo que si hay más de una mayor a 5000, todas saldrán de la columna a la vez, tendrá que usarse otro polímero con distinto rango de fraccionamiento.

Procedimiento

Empaquetado de la columna (Material se deja hinchar para formar el gel), preparación de la muestra (En fase móvil y se aplica al lecho cromatográfico), ilusión (Muestra penetran lecho, se añade fase móvil para eludir las moléculas y se va recogiendo el eluato en fracciones.), análisis y regeneración de la fase estacionaria.

Aplicaciones

• Método analítico: determinar peso molecular y estructura cuaternaria nº subunidades= PM (Filtración en gel)/ PM (SDS-PAGE).
• Método preparativo: Delasar: se utilizan sales para purificar proteínas; Eliminar reactivos; separar mezclas de proteínas.

Cromatografía de intercambio iónico:

Retiene aquellos componentes de la muestra que tienen la carga opuesta. Dos tipos de cromatografía en función del ión que retienen:

• CI catiónico: fase estacionaria de carga negativa.
• CI Aniónico: fase estacionaria de carga positiva.

Procedimiento

Se utiliza como fase estacionaria esferas de polímeros con grupos funcionales ionizables unidos covalentemente como intercambiadores catiónicos (Carboximetil-celulosa.) o aniónicos (Dietilaminoetil-celulosa).

Fases

Empaquetamiento de la columna; Equilibrado; aplicación de la muestra; lavado; Elución; regeneración de columna.

Separación por intercambio del analito con el intercambiador de carga opuesta; elución por aumento de la fuerza iónica del eluyente o cambios de pH. Purificación y análisis de proteína, aminoácidos y nucleótidos.

Cromatografía de afinidad:

Elevada especificidad. Fase estacionaria como esferas Unidas a un ligando, se aprovecha la afinidad biológica de los compuestos para purificar la muestra. Si queremos retener una enzima, podemos utilizar como ligando su sustrato cofactor o un inhibidor. Si es una hormona, se puede utilizar en receptor un antígeno, un anticuerpo. Es importante que haya una alta especificidad, afinidad, irreversibilidad. Los compuestos que no presentan afinidad se eliminarán en los lavados.

Elución: la proteína retenida se eluye aumentando la fuerza iónica, cambiando el ph del solvente o con ligando competidor.

Aplicaciones

Purificación de proteínas y del ARMm. Purificación de ARNm por cromatografía de afinidad:

• Equilibrado: empaquetado de columna con fase estacionaria y equilibrado con tampón con elevada sal para reducir interacciones inespecíficas.
• Preparación de la muestra: se prepara en fase móvil y se añade a la columna.
• Elución: aumentar [ligando competidor], cambiar pH de fase móvil…
• Regeneración de la columna: para uso posterior, se lava con urea para retirar toda proteína unida no específicamente y después se equilibra con fase móvil para regenerar la columna.

Electroforesis

Técnica mediante la cual se separan Biomoléculas cargadas mediante su desplazamiento diferencial en un campo eléctrico. Las moléculas se separan desplazándose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor sea la carga de la molécula. Fuerza de campo eléctrico, viene determinada por la carga del Ion y la intensidad del cargo eléctrico. Ff= tamaño * forma; Velocidad directamente proporcional a la carga y a la intensidad del campo eléctrico. Inversamente proporcional al coeficiente de fricción que depende del tamaño y forma de la molécula.

Electroforesis Libre: limitaciones: resolución muy pobre, difusión, mezcla por convección por la temperatura que se alcanza en esta electroforesis. El desplazamiento de los iones se detecta por cambios en el índice de Refracción. Arne Tiselius 1948 tubo U. Medios de soporte: libre o de frontera móvil; De zona (En papel, en acetato de celulosa, en gel De Almidón policrilamida o Agarosa). el campo eléctrico se aplica a un soporte estabilizante. Zonas discretas. Posiciones finales de los iones se pueden fijar por tinción por ej.

Electroforesis de zona: Se usan soportes Para estabilizar el medio, tiene un gran poder resolutivo. Consiste en la separación de mezclas complejas aplicando pequeñas cantidades de la muestra sobre un soporte formado por polímeros que forman un gel poroso que restringe los movimientos de las moléculas.

• Papel y acetato de celulosa: la fricción es mínima. Los compuestos se separan por su diferencia de carga. Se puede utilizar con moléculas de pequeño tamaño porque tiene baja resolución. Se analiza aminoácidos, péptidos pequeños y proteínas del suero. Se utiliza para separación de aminoácidos analíticas plasmáticas.
• Geles de poliacrilamida o agarosa: geles de Almidón: para la separación de proteínas. Geles de poliacrilamida: para separar proteínas, ADN O ARN de menos de 100pb. Geles de agarosa: con poros más grandes para ácidos nucleicos, ADN y ARN.

Las moléculas que más avancen serán de menor tamaño, ya que son capaces de avanzar rápidamente entre los poros. Todos los geles son matrices porosas que ejercen un efecto de tamizado y habrá cavidades. A parte de la carga también interviene el tamaño y forma de la molécula.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: SDS-PAGE

Purificación de proteínas, determinar su tamaño o peso molecular y el número de subunidades que la forman. Se emplea geles de poliacrilamida en presencia de detergente SDS.

Componentes del tampón

Se desnaturaliza proteínas SDS desplegando las cadenas polipeptídicas (misma forma) la separación dependerá del tamaño de una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, por lo que la carga negativa del SDS es más cara la del aminoácido. Cuanto más pequeña es una proteína, más avanza en el gen. El B-mercaptoetanol rompe o reduce puentes disulfuro, separa las subunidades. También se añade Glicerol, para evitar que la muestra tenga la misma densidad que el tampón de electroforesis; aumentan la densidad de la muestra, Azul de bromofenol permite ver la banda, avanza más rápido por lo que marca la movilidad máxima = marca el frente; es un colorante de localización y Tris-HCl a un pH determinado. Al final de la electroforesis, se tiñe con Azul de Coomassie y se calcula la movilidad relativa (M; movilidad relativa = Q/f; G es la carga y f es la forma, tamaño. M está relacionado inversamente con la masa; los que tengan mayor masa avanzarán más despacio = tendrán menos movilidad electroforética).

En el gel concentrador tenemos un pH de 6.8, mientras que la glicina tiene un pH de 6.06, por lo que su movilidad es pequeña, ya que casi no tiene carga. Mientras que el cloro tendrá mucha movilidad. Concentra la masa para aumentar la resolución, formando una banda muy fina, de forma que entrarán todos a la vez en el gel separador donde se separarán por el tamaño. Tiene un tamaño de poro muy grande y no habrá restricciones en el tamaño de las proteínas, lo que facilita su movilidad. El pH del segundo gel (separador) es de 8.8, por lo que la glicina tendrá más movilidad, de manera que adelantan a la proteína, siendo el orden de movilidad: prot Aplicaciones: determinar la masa tinte azul, estructura cuaternaria en el gel (hay subunidades porque con el detergente se ha desnaturalizado, Si se compara con una cromatografía sin detergentes podemos ver en cuantas bandas se separan), pureza.

Isoelectroenfoque

Método donde las proteínas se van a separar en función de diferencias en su PL. Se usan moldes tubulares.

Características de los geles

Debe ser con poros grandes porque el tamaño de la proteína no debe influir en el desplazamiento, por tanto, geles con baja concentración de acrilamida. No tiene SDS porque daría carga negativa a todas las proteínas, se usa detergente sin carga; El gradiente de PH, La zona más próxima al ánodo tendrá un ph básico. La más cercana al Ánodo tendrá ph positivo; La muestra contendrá anfolitos, compuestos químicos sintetizados con distintos pl en función de los PL de las proteínas que queramos separar; inmovilinas: Derivados de acrilamida con grupos ácidos y básicos. La proteína se detiene donde el PH sea igual al Pl, donde la carga neta es cero.

Electroforesis bidimensional

Soluciona las limitaciones que tenemos al analizar distintas proteínas con la misma masa o mismo pl. La primera dimensión es isoelectroenfocque y se incuba con SDS, para llevar a cabo la segunda electroforesis SDS-PAGE. Se coloca el gel en posición horizontal enzima de poliacrilamida con SDS. Se aplica el campo eléctrico en dirección perpendicular. Para teñir se usa nitrato de plata. Las únicas que no conseguiremos resolver son las que tengan el mismo pl y el mismo tamaño.

Tiene mucho uso en el campo de la proteómica: conjunto de proteínas expresadas por un organismo y una célula determinada, se detectan cambios en las condiciones de expresión en patologías o tratamiento patológico. se pueden detectar proteínas marcadoras para diferentes enfermedades o bien a modo de proteína diana para tratamientos.

Electroforesis en gel de ácidos nucleicos

La agarosa es un polímero de galactosa. Forma una red con cierto grado de porosidad. Tiene poros más grandes que el de poliacrilamida por eso se utiliza con ácidos nucleicos, que son más grandes que las proteínas. Cuanto menor sea el porcentaje de agarosa, más laxo será nuestro gel. Si se sube la concentración más de 2%, para separar fragmentos muy pequeños no debemos aumentar la concentración de agarosa pues el gel será opaco, entonces, la solución está en usar un gel de poliacrilamida. Para valores superiores a 60kb (cromosomas enteros), se emplea una electroforesis en campo pulsante.

• ADN DOBLE CADENA: Se separan en función de su densidad de carga pues todas se desplazan en la misma dirección (todas las moléculas de ADN tienen carga negativa). La forma es lineal y no influye.
• ARN: Si son de una cadena, pueden tener cadenas complementarias y se forman muchas estructuras secundarias distintas. Hay que usar desnaturalizantes fuertes para desnaturalizar esas complementaciones.
• ADN CIRCULAR DE DOBLE CADENA: Las superenrolladas avanzan a mayor velocidad. El ADN relajado es que el que menos se desplaza siempre.

Visualización

Bromuro de etidio: tóxico. Se inserta en las bases de ADN por lo que puede generar mutaciones. Absorbe luz UV y emite luz naranja. No se analiza en la luz UV porque si está muy expuesto se dañan los ácidos nucleicos, por lo que se trabaja sobre una fotografía. También se pueden introducir en el gel para ver el avance según avanza la electroforesis.

Aplicaciones

Determinación del tamaño, interacciones DNA-proteína, mapas de restricción y productos de PCR insertos.

Centrifugación

Técnica para separar partículas biológicas que difieren en tamaño, forma o densidad. Técnica de sedimentación acelerada mediante la aplicación de un campo centrífugo puede usarse para separar células, orgánulos o macromoléculas. Fg (fuerza gravedad)= Ff (resis friccional) + Fb (fuerza flotación).

Instrumental

• Tubos de centrífuga: de policarbonato, polipropileno o polietileno. Hay que llenar el tubo lo máximo posible cuando se centrífuga con mucha fuerza. A muy alta fuerza centrífuga encajan mejor los de Fondo Redondo, aunque los de fondo Cónico sedimentan mejor.
• Rotores de centrífuga:
  • Rotor de ángulo fijo: La muestra se encaja siempre en un ángulo de 20º-40º. Las partículas deben hacer un recorrido corto hasta depositarse. El campo centrífugo no es de uniforme, será más pequeño en la parte menos profunda del tubo y más grande en la más profunda.
  • Rotor vertical: Como el pellet no es tan compacto como en el ángulo fijo, a veces se Junta con el Sobrenadante. Se utilizan técnicas de centrifugación en gradiente de densidad. Campo más uniforme, misma fuerza en todo el tubo.
  • Rotor de brazo basculante.
• Centrífugas: se clasifican en función de la velocidad máxima que puedan llegar a alcanzar.
  • Centrifuga de mesa: alcanzan velocidades máximas de las 10.000 rpm. No es necesario un sistema de refrigeración, para sedimentar celulas de un medio de cultivo o nucleos. Tiempos cortos. Para material que sedimenta muy rapidamente, pequeños precipitados.
  • Centrífuga de alta velocidad: puede llegar hasta las 20.000 rpm (entre 10.000 y 20.000 rpm) disponen de una bomba de vacío para eliminar el aire y que no se eleve la temperatura dentro de la centrífuga, que podría desnaturalizar las muestras. Suelen tener temporizadores y control de temperatura.
  • Ultracentrífugas: Más de 20.000 rpm, pueden alcanzar 150.000 rpm. Para centrifugar ribosomas.
  • Ultracentrífuga analítica: para determinar alguna propiedad, como el coeficiente de sedimentación. El coeficiente de sedimentación = V / Campo centrífugo.

Modalidades de centrifugación

• Preparativa:
  • Diferencial: Vamos a tener dos fracciones, el sedimento y el sobrenadante.
  • Fraccionamiento subcelular: sedimentan en función de su coeficiente de sedimentación, primero las de mayor tamaño y por último las más pequeñas. Se utiliza para separar las fracciones de las celulas. Primero deben romperse las celulas con homogeneizador, el que se mete la muestra junto a un detergente. Primero sedimentan núcleos y celulas intactas, luego mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, después microsomas y partículas pequeñas y por último ribosomas con ultracentrifugación. Mediante este metodo no se pueden separar moléculas con similares coeficientes de sedimentación, deben usarse métodos complementarios.
• En gradiente de densidad: la densidad va aumentando desde la parte superior al fondo del tubo, con sacarosa o sales como el cloruro. Tendra tantas fraccciones con particulas haya en la muestra.
  • Centri. Zonal: Se utiliza un gradiente de densidad preformado, que puede ser continuo o discontinuo, que se forma antes de incluir la muestra. Aprovechamos diferencias en el tamaño o forma, coeficiente de sedimentación. Encima del gradiente se colocan las muestras. Para evitar que se formen. Discontinuo, se usa sacarosa. Para un gradiente continuo se suele usar un aparato donde se coloca un medio de baja densidad y uno de alta y van colocándose en un tubo con un gradiente de densidad. Hay que controlar el tiempo para que se separen todas las partículas sin que se depositen todas al fondo del tubo.
  • C. Isopicnica: se separa solo en base a la densidad, independientemente del tamaño o la forma, o del coeficiente de sedimentación. Pueden utilizarse gradientes preformados o autogenerados. En los autogenerados tenemos, por ejemplo CSC12, en ell que aplicamos la muestra y centrifugamos. La muestra se dispondrá en bandas, las partículas se depositaran en la zona en la que su densidad sea igual a la del medio. Se usa para purificar ácidos nucleicos.

Técnicas isotópicas

Naturaleza de la radioactividad: Los isótopos estables son aquellas cuya composición nuclear no varía con el tiempo. Los inestables son aquellos que sufrirían cambios en su composición nuclear. La estabilidad de un isótopo viene determinada por el número de protones y neutrones. Cuanto más parecidos sean, más estables serán. Los inestables tenderán a la estabilidad desintegrándose para formar isótopos estables.

Desintegración radioactiva

• Desintegración beta – : sintetizar proteínas y marcar adn. La energía máxima es específica de cada radioisótopo. Los métodos para medir el tritio y el P 32 son diferentes y las medidas de seguridad también cambian, ya que el H3 emite mucho menos energía que el P32. El H-3 no tiene suficiente alcance si se trabaja con él externamente, pero sigue siendo peligroso si se ingiere.
• Desintegración beta +: emisión de un positrón.
• Captura electrónica: captura de un electrón por parte de un núcleo atómico.
• Desintegracion gamma: marcaje de hormonas, insulina horona del crecimiento, anticuerpos, proteínas. Estas emisiones no tienen ni carga ni masa pero tienen muchísima energía, son muy energeticos. A mas corta longitud de onda, mas energia, Por tanto, tienen un poder de penetración muy alto, por eso debe utilizarse pantallas de plomo que evitan la radiación. Tiene lugar tras una desintegración en I que ha habido emisión de partículas. el estado fundamental, EO, A veces se pasa de un estado fundamental a un estado energético o excitado, debido a que tras una esintegración la energía se queda en el nucleo, para volvver a la estabilidad y, por tanto al estado fundamental debe emitirse energía.

Ley de desintegración radiactiva

Velocidad de desintegración o actividad = – dN/dt (Núcleos que se han desintegrado) = λ(cte de desintegración radioactiva)*n. La constante de desintegración radiactiva es el porcentaje de isótopo que se desintegra en una unidad de tiempo. El periodo de semidesintegración es el tiempo que pasa hasta que la mitad de los isótopos inestables inicial iniciales se desintegran. Se vuelven estables. T1/2 = cte = ln2/ λ = periodo de Semidesintegración. Curio: actividad absoluta en 1 gr de radio. Se utiliza muy poquito porque tiene mucha actividad radioactiva. Lo que un detector es capaz de detectar se contabiliza mediante CPM (cuentas por minuto) o CPS, es la actividad relativa. La eficiencia de contador quiere decir que se tiene una muestra reactiva y el contador tiene una eficacia del 81% por cada 100 DPM solo cuenta o reconoce 81. La actividad específica es la actividad por unidad de masa.

Medición de la radioactividad

• Radioactividad beta – :
  • Detector de ionización de gases: para medir la radioactividad de p 32; de muy alta energía. la partícula beta -expulsada por la muestra. Al colisionar con átomos se forman pares iónicos hasta que La partícula disipa por toda su energía. Se produce corriente eléctrica que se registra en cpm o CPS, dependiente de la energía y el número de partículas que se tienen. El titio y otras moléculas menos energéticas no tienen energía suficiente para formar pares iónicos.
• Método de Centelleo líquido: Para medir elementos de baja energía (titrio, c14). Se añadirá a la muestra un líquido en el que queda disuelta por completo. El liquido de centelleo debe contener un disolvente como dioxano, xyleno,… son anillos aromáticos, que participarán en el cambio energético. También presentara un fluoroforo primario y uno secundario (los centelladores) absorben energía a cierta longitud de onda y lo reflejan a una longitud de onda mayor. Convertirán la energía de las articulas en fotones de luz visible que puedan ser detectada por un fototubo. El disolvente absorberá la energía, se excitará, pero sigue siendo demasiada energía para que I absorba el disolvente, y lo hará el fluoroforo primario y más tarde al secundario, excitándose y produciendo fluorescencia.
• Radiación gamma: método de Centelleo sólido: Su forma cilíndrica le permite captar la mayoría de las radiaciones gamma. Las radiaciones beta excitan el talio que emite fotones que se puede contabilizar