Elementos del Sistema HPLC

• Frascos de reserva de disolventes
• Módulo de inyección (manual o automático)
• Columna precedida de la precolumna
• Módulo de bombas
• Desgasificador en línea (opcional)
• Termostatizador de columnas (opcional)
• Tubos y piezas de conexión
• Detector
• Sistema de adquisición y tratamiento de datos

Válvula de 6 Vías

Los puertos se conectan por parejas: 1-2, 3-4, 5-6 en una posición y 2-3, 4-5, 6-1 en la otra.

Inyección Manual

Dos puertos están conectados mediante un tubo de acero de volumen conocido (bucle). Para la carga, se utiliza una jeringa para lavar y cargar el bucle con la muestra, con el desagüe abierto. Para la inyección, al girar la válvula (60º en sentido antihorario), el contenido del bucle se inserta en el flujo a presión que proviene de la bomba hacia la columna.

Inyección Automática

La columna se representa en la posición de carga. La bomba auxiliar lava y llena la aguja y el bucle de espera con el volumen programado. Un brazo robotizado coloca la aguja sobre el asiento, quedando unidos herméticamente. El giro de la válvula inserta el contenido del bucle en el circuito de alta presión, entre la fase móvil que viene de las bombas y la que sale hacia la columna.

Bombas

Bombas de Alta Presión o Binarias

Los disolventes se mezclan después de haber sido presurizados. Están constituidas por 2 módulos de doble pistón. Cada módulo comprime un disolvente, realizándose la mezcla a alta presión a la salida de los módulos. Para cambiar la composición de la mezcla, el recorrido de un módulo aumenta y el del otro disminuye. Ventaja: La mezcla se realiza con mayor precisión y el caudal es más constante y preciso.

Bombas de Baja Presión o Cuaternarias

Los disolventes se mezclan antes de entrar a una bomba de doble pistón. La mezcla la realiza una válvula programable que tiene 4 entradas y 1 salida. La composición de salida depende de los tiempos de aspiración para cada canal. Los segmentos se mezclan durante su recorrido hacia la bomba.

Columnas Monolíticas

La fase estacionaria es continua (sin partículas) y está hecha de un material (sílice o polímero orgánico) rígido de estructura microporosa muy homogénea. Se pueden funcionalizar, enlazando una fase estacionaria del mismo tipo que en columnas particuladas. Ventajas: Mayor facilidad de construcción (sin fritas), menor retraso en la transferencia de masa (regularidad de poros), menor resistencia al flujo (macroporos forman una red de canales) y mayor duración (mecánicamente más estables).

Relleno de Columnas

Ventajas: Las técnicas de fabricación están más perfeccionadas (reproducibles), existe una gran variedad de rellenos estandarizados y la bibliografía sobre separaciones se ha perfeccionado.

Temperaturas Elevadas

Se debe utilizar un tubo restrictor de presión. Ventajas: Disminuye la viscosidad de la fase móvil, se requiere menos presión y la eficacia es más alta ya que C disminuye. Mejora la solubilidad de ciertos solutos en la fase móvil y modifica la selectividad de ciertos solutos. Desventajas: Se reduce la vida de la columna, se pueden destruir solutos termolábiles y se reducen los tiempos de retención (tR).

Regla de Schoenmakers

Para que los solutos eluyan dentro de la zona óptima de valores k y aparezcan resueltos: a) di ≈ (dm + ds) / 2; b) dm y ds muy distintos entre sí.

Optimización de la Selectividad en Elución Isocrática

El primer disolvente a probar es ACN, ya que es menos viscoso y para detección UV-Vis tiene λ de corte muy baja. MeOH tiene una viscosidad intermedia y λ intermedia. THF alcanza el equilibrio fase móvil-fase estacionaria más lentamente. MeOH es más básico, ACN más ácido y THF más dipolar.

Detección Refractométrica

Se basa en la medida del cambio del índice de refracción del eluato producido por la presencia de solutos. Ventajas: Es universal, especialmente útil para análisis de compuestos que no absorben en el UV/Vis. Inconvenientes: No es útil en el análisis de trazas, no se puede utilizar en elución en gradiente y el intervalo dinámico lineal es pequeño.

Detectores Evaporativos

Detector de Dispersión de Luz (ELSD)

En el nebulizador, el eluato se transforma en un aerosol al colisionar con N2 a presión al salir por una boquilla. En el tubo de desplazamiento, el disolvente se evapora y los solutos no volátiles quedan en suspensión. La detección se produce por dispersión de luz. Ventajas: Solo se detectan solutos no volátiles y permite detectar compuestos sin cromóforo. Los límites de detección (LODs) son más bajos que el refractométrico. Inconvenientes: El intervalo dinámico lineal es muy corto, la fase móvil puede tener tampones no volátiles y se pierde sensibilidad cuando se trabaja a caudales bajos.

Detector de Aerosol Cargado (CAD)

Los componentes volátiles del aerosol se evaporan en un tubo caliente. Las partículas restantes pasan por una cámara donde se encuentra un electrodo sometido a un potencial de unos pocos miles de voltios. Los electrones chocan con las moléculas de nitrógeno y las ionizan. El N2 ionizado reacciona con las moléculas del disolvente, dando lugar a otros iones que cargan a los solutos. La carga es recogida, dando una señal proporcional al soluto presente. Ventajas: Respuesta más reproducible que el ELSD, LODs más bajos e intervalo dinámico lineal amplio.

Detección Amperométrica

Se basa en la medida de la corriente producida cuando un soluto se oxida o se reduce en contacto con un electrodo sometido a un potencial eléctrico. Consta de: electrodo de trabajo (donde se oxidan o reducen los solutos electroactivos), electrodo de referencia (para fijar el potencial del electrodo de trabajo) y electrodo auxiliar (para impedir que circule corriente por el electrodo de referencia). Ventajas: Solo se detectan compuestos electroactivos, se alcanzan LODs muy bajos y el intervalo dinámico lineal es muy amplio. Inconvenientes: No es universal (ventaja cuando interesan ciertos solutos en matrices complejas), solo fases móviles con %H2O muy alto libres de oxígeno, muy sensible a cambios de flujo y temperatura, y facilidad con la que se ensucia el electrodo.

Espectrometría de Masas (MS)

La discriminación soluto-disolvente se produce al hacer pasar los iones por un capilar donde circula N2 en contra, seguido de zonas a presiones cada vez más reducidas. Bajo la acción del campo eléctrico, solo los iones atraviesan el capilar.

Ionización por Electronebulización (ESI)

Se aplica una diferencia de potencial entre la punta del nebulizador y un contraelectrodo. Las gotas se cargan al salir del nebulizador. El disolvente se evapora y los iones se concentran en las gotas hasta que estallan por la repulsión. Se repite el proceso hasta que solo quedan moléculas de disolvente e iones en fase gas. Los iones son atraídos hacia la entrada del capilar. Ventajas: El proceso de ionización es muy suave y se obtienen moléculas policargadas. Trabaja a presión atmosférica.

Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI)

La ionización se produce por impacto electrónico después de la nebulización. Las moléculas de N2 chocan con electrones rápidos y las ionizan. El N2 reacciona con las moléculas del disolvente, que a su vez reaccionan con los solutos.

Ionización Fotoquímica (APPI)

Los iones se generan después de la evaporación mediante irradiación con luz UV. Se añade a la fase móvil una pequeña cantidad de disolvente absorbente de radiación UV. La radiación ioniza a la acetona, que a su vez ioniza los solutos.