Comportamiento global de una columna HPLC: naturaleza de la partícula que conforma el relleno y la derivatización química (la química del enlace) que se aplica a la partícula y que confiere la selectividad a la columnaaTipos de columnas : a pH alto la sílice se disuelve. Ventajas de las partículas superficialmente porosa: Mayor eficiencia • Mayor resolución y sensibilidad • Tiempos de análisis más cortos • Reducida contrapresión de trabajo. Desventajas: Disolución de la sílice a pH básico • Menor capacidad de carga a causa de su baja área superficial específica • La menor retención puede ser una desventaja Columnas monolíticas: Los monolitos son columnas que se fabrican con fases homogéneamente continuas y no con partículas individuales y pueden fabricarse con base polimérica o sílice ; ventajas: Separaciones más rápidas a la mitad de contrapresión • Análisis de muestras sucias y viscosas • No alteraciones del lecho debidas a compresión: aumento significativo de la vida útil de la columna • Eficiencia de separación muy elevada mediante acoplamiento de columnas • Mayor rendimiento de la muestra – separaciones más rápidas desventajas: Disolución de la sílice a pH básico • Limitadas opciones de fase estacionaria • Eficiencia limitada. Partículas de organosílice híbrida: ventajas: estables a mayor rango de pH- mejora la retención de base spolares-proporcionan mejores pendientes de pico. desventajas: reducidas fases estacionarias – mayor coste Parámetros físico–químicos de las columnas: tamaño de partícula: eficiencia aumenta al disminuir el tamaño- la contrapresión aumenta al disminuir el tamaño- columnas cortas con tamaño de partículas pequeño permite mantener resolución en tiempos cortos – columnas empacadas con partículas de núcleo sólido permiten aumentar la eficiencia sin aumentar la contrapresión. tamaño del poro: La microestructura porosa creada durante la formación de las partículas de sílice, está caracterizada por una distribución de tamaño de poro determinada. Carga de carbono: Cantidad de fase estacionaria enlazada a la sílice. • Cuanto mayor es la CC más hidrofóbica es la fase estacionaria y mayor es la retención. Área superficial: Se define como el material disponible en la columna para interaccionar con los analitos • Cuanto mayor sea el área superficial, mayor es la interacción y por tanto mayor la retención.

Definiciones (1): exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de una medida (xi ), o la media de n resultados (X), y el valor considerado como verdadero del analito de interés en la muestra problema. Precision: Grado de concordancia entre un grupo de resultados, obtenidos al aplicar de forma repetida el mismo método a una misma muestra” Repetibilidad: Dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipamiento y en un intervalo de tiempo relativamente corto Reproducibilidad: lo mismo pero distintos operadores, equipo, laboratorio… Sensibilidad: Capacidad para discriminar entre concentraciones semejantes de analito. LOD: Concentración mínima de analito que se puede detectar pero no cuantificar LOQ: Concentración mínima de analito que se puede cuantificar. Selectividad: Capacidad para originar resultados que dependan de forma exclusiva del analito/os para su identificación o cuantificación en la muestra.

Comportamiento global de una columna HPLC: naturaleza de la partícula que conforma el relleno y la derivatización química (la química del enlace) que se aplica a la partícula y que confiere la selectividad a la columnaaTipos de columnas : a pH alto la sílice se disuelve. Ventajas de las partículas superficialmente porosa: Mayor eficiencia • Mayor resolución y sensibilidad • Tiempos de análisis más cortos • Reducida contrapresión de trabajo. Desventajas: Disolución de la sílice a pH básico • Menor capacidad de carga a causa de su baja área superficial específica • La menor retención puede ser una desventaja Columnas monolíticas: Los monolitos son columnas que se fabrican con fases homogéneamente continuas y no con partículas individuales y pueden fabricarse con base polimérica o sílice ; ventajas: Separaciones más rápidas a la mitad de contrapresión • Análisis de muestras sucias y viscosas • No alteraciones del lecho debidas a compresión: aumento significativo de la vida útil de la columna • Eficiencia de separación muy elevada mediante acoplamiento de columnas • Mayor rendimiento de la muestra – separaciones más rápidas desventajas: Disolución de la sílice a pH básico • Limitadas opciones de fase estacionaria • Eficiencia limitada. Partículas de organosílice híbrida: ventajas: estables a mayor rango de pH- mejora la retención de base spolares-proporcionan mejores pendientes de pico. desventajas: reducidas fases estacionarias – mayor

Factores que afectan a la eficiencia de la columna:-La longitud de la columna: a más larga mayor eficiencia, porque los analitos salen más diferenciados.- Diámetro de la columna: cuanto más pequeño mayor número de platos tendrá. – Tamaño de las partículas del empaque: deben ser pequeñas para que la columna sea muy eficiente.- Naturaleza de las fases: afecta mucho.-Grosor de la fase estacionaria: si es muy gruesa, el equilibrio entre la ase estacionaria y el analito es más lento, por lo que da lugar a picos anchos- Temperatura de la columna: a temperatura muy alta los compuestos salen más rápido por el final de la columna, por lo que tendremos menos eficacia. – Velocidad del gas portador: cuanto más rápido sea el flujo, a mayar velocidad salen los analitos al detector lo que puede llevar a solapamientos de picos y por tanto a una eficacia menor. – Cantidad de muestra inyectada: mejor cuanto menor carga de muestra se introduzca en la columna.

Tipos de cromatografia HPLC: cromatografia de reparto: puede subdividirse en -cromatografia liquido-liquido (FE liquido en soporte solido mediante adsorcion fisica) -fase unida quimicamente(FE se une quimicamnte a la superficie del soporte). Columnas sílice rígida (poner hidrolisis, organoclorosiloxanos (c18) y clorometilsilano) cromatografia en fase normal: separacion compuestos muy polares- FE(polar) FM (apolar) – a mayor polaridad mas retenido.- disolventes mas polares disminuyen Tr. Cromatografia fase reversa: Fe(apolar) FM(polaridad moderada)- analitos +polares eluyen antes. -Tr aumenta con la adicion de disolventes polares.- compuestos con cadena larga de alquil se retienen mas porq aumenta la hidrofobicidad aunq si el tamaño d ela molecula es grande la interaccion puede ser menor.-factores que afectan a la separación : adicion sales inorganicas y pH . C.pares ionicos: crmatografia de fase inversa utilizada en separaci y identif d species ionics. FM- disoluciion tampn acuosa (dislv organic +comp ionico que aporta contraión analito) el contraion reacciona cn analito formando pareja de iones (neutros) que son retenidos en la FE. C. adsorcion: fases utilizadas silice y alumina – variable para optimizar k y alfa es la cmposicion FM. para elegir disolvente uno demasiado fuerte y otro debil. CI intercambio ionico: procesos basados en equilibrios de intercambio entre iones de una disolución y otros del mismo signo en la superficie  de un solido elevado PM e insoluble.- Fm: disoluciones acuosas contienen tampon con especies ionicas que compiten con los del analito por los sitios activos del intercambiador. -Columna supresora: segunda columna rellena de resina de intercambio ionico que convierte iones del eluyente en especies moleculares poco ionizadas sin alterar iones del analito

C liquida exclusion x tamaño: -moleculas grndes avanzan rapido por intersticion y pequeñas retenidas por las fibras de las microparticulas. FM: debe arrastrar los diferentes componentes y la muestra debe ser soluble en la FM. parámetros: -a mayor viscosidad menor reproducibilidad – mayor tmpratura ->mayor difucion->mejor resolucion – Valrs fuerza ionica altos :favorcn intercambio ionico soluto-FE y valores menores interacciones hidrofobicas – el pH –mayor flujo eluyente-> menor eficacia. FE: uniformidad granulos y poros – estabilidads pH y tmperatrura – maxima inercia frente compuestos a separar – resistncia altas presiones. C de afinidad: se basa en uniones reversibles entre analito y ligando inmovilizado sobre soporte inerte. La interacciones son altamente especificas y las moleculas no retenidas son eliminadas x lavado. el cambio de valores como pH facilita la elucion del analito debilitando enlace cn ligando.  Cromatografia plana : La fase estacionaria es polar y la fase movil apolar, los analitos hidrofobicos se quedan arriba mientras que los hidrofilicos abajo,

Cromatografia de gases: la muestra se inyecta en una corriente d gas inerte y arrastra a traves de una columna en la que los componentes se separan en funcion de su capacidad para distribuirse entre  las fases movi y estacionaria. – puede ser GLC ó GSC. Fase movil: -N2 (separaciones eficaces, bajas V de flujo y analisis largos) , H2/He( menos eficaces, altas V de flujo y analisis cortos) H2(explosivas reaccionan cn muestra e inflamable) Columnas: Empaquetadas: elevada superf x unidad volumen -establidad termica – dureza mecanica suficiente – gran inercia quimica baja resistencia frente paso fase movil – bajo tamaño de particulas mayor eficacia  Columnas capilares:  WCOT (c capilares abiertas de pared recubierta): FE recubre pared interna, baja capacidad de carga, deterctores muy sensibles. -columna capilar de soporte recubierto (SCOT): FE liquida retenida x soporte solido, mas capacidad de carga y menor eficacia. Fase estacionaria: baja volatilidad a temperatura de columna – estabilidad termica a temperatura de columa – inercia quimica – baja viscosidad – polaridad adecuada- espesor adecuado

sistemas de ionización : Impacto electronico (EI): La moléculas que vienen separadas de la columna, la hacemos pasar por una corriente de electrones generada por un filamento y atraida por un iman que al interaccionar con los analitos, el exceso de energia da lugar a la formación de iones. se coloca un repeler de voltaje positivo para que los iones sean repelidos y vayan hacia la placa de salida. tambien hay placas negativas que se usan como lentes de aceleracion y de enfoque para llevar los iones al analizador. Ionización química: un gas reactivo es introducido en una fuente ionica de forma controlada, el cual, es bombardeado con electrones generandose una serie de especies nuevas. (hablar de concentracion del gas). las moleculas de la muestra interaccionan con los iones del gas reactivo y se ionizan. el sistema puede estar configurado en modo positivo (PCI) o negativo (NCI). se utiliza para confirmaciones de peso molecular. Problemas acoplamiento LC-MS: HPLC : – separacion en fase liquida a alta presión- produce una alta carga de vapor – temperatura proxima a ambiente – sin limites de rango de masa – puede utilizar tampones no volatines MS: -se necesita alto vacio – tolera una carga de gas limitado – opera a temperatura elevada – depende de m/z y del tipo de filtro de masas – prefiere tampones volatiles.  introduccion de la muestra acoplamiento : el efluente de la columa se evapora mediante tempratura a su paso por un capilar calentado electricamente. el vapor producido actua como gas nebulizacion y ayuda a desintegrar el liquido en gotas. estas gotas se someten a desolvatacion a medida que atraviesan una region calentada de la interfaz y los iones se forman a partir de analitos contenidos en la corriente d eliquido por medio de reacciones ión-molecula.  Electrospray (ESI): se aplica una tension entre el capilar de entrada y el contraelectrodo. debido al intenso campo electrico la muestra sale del capilar en forma de aerosol. Al avanzar por la camara de desolvatacion, llega un punto donde su tamaño es tan pequeño que las fuerzas culombianas de repulsion entre los iones son capaces de vencer la tension superficial y se produce la evaporacion ionica.

analizadores (1): analizadores cuadrupolares: 4 cilindros alineados y equidistantes entre si. mediante la aplicacion de voltajes de corriente continua y de radiofrecuencia superpuestos, s econsigue q iones de masas determinadas pasen por el tunel siguiendo trayectorias oscilantes estables que las dirigen al detector. variando estos voltajes conseguimos enfocar de modo sucesivo las diferentes masas y obtener así el espectro. ventajas: costo, menor tamaño y gran robustez, mayor velocidad barrido, mayor facilidad de conexion a sistemas de ionizacion a presion artmosferica. – desventajas: limitada resolucion, baja sensibilidad a altas masas y menor rango d masas. Modo full scan: el espectrometro examina todo el rango de masas obteniendo espectros mas completos. ideal para analisis cualitativo para identificacion de compuestos. ventjs:- elevada informacion estructural – informacion sobre compuestos no esperados – bibliotecas de espectros. invonvenientes  -menor sensibilidad. SIM: se examina numero limitado de iones caracteristicos de los compuestos en un intervalo dado del cromatograma . perfecto para analisis cuantitativo. dwell time: tiempo que el analizador deduda a observar un ion determinado. ventajas: elñevada sensibilidad – mayor selectividad – mejor reproducibilidad cuantitativa – permite identifiacion compuestos que coeluyan. inconvenientes : escasa info estructurtal – no biblioteca de espectros- solo analisis compuestos conocidos. triple cuadrupolo (MS/MS); Q1: seleccion ion precursor Q2 celda de colision (fragmentacion del ion= Q3 analisis de iones fragmento.

Analizadores (2): Trampa de iones: Se produce la ionización, almacenamiento de iones, barrido de masas y detección en un mismo recinto con una secuencia rápida de tiempo controlada por la función de SCAN. El recinto tiene tres electrodos, la ionización se produce por impacto electrónico, los iones producidos quedan atrapados en la cavidad de la trampa mediante campos eléctricos, la separación se produce mediante la aplicación de una rampa de radiofrecuencia aplicada a un electrodo que desestabiliza los iones de M/Z creciente, expulsándolos de la trampa. Los iones salen de la parte superior o inferior de la cavidad, los que salen por la parte inferior son detectados por un multiplicador de electrones situada en la base del dispositiv. ventajas: diseño simple bajo coste, elevada eficacia de coleccion d eiones. alta sensibilidad y versatilidad. desventajas: probabilidad de las interacciones espacio-carga disminuye la sensibilidad y resolucion. – los espectros pueden presentar protonacion – limitada resolucion- menos sensible en SIM que FULL SCAN. triple cuadrupolo-trampa de iones lineal: Q3 está modificado para atrapar iones, sobre Q3 se aplica una energía que permite el flujo de iones y al final de este se aplica un voltaje que bloquea la salida de iones. De esta manera se consigue mantener los iones en Q3 durante un tiempo, llamado tiempo de llenado, antes de ser expulsados hacia el detector, lo que produce que aumente la densidad de iones de un analito que llega al detector al mismo tiempo, por lo que aumenta la sensibilidad. ventajas: mayor capacidad de almacenamiento de iones, tiempos d eexploracion mas rapidos.

analizadores(3): tiempo de vuelo (TOF): Se evita que los iones salgan de la fuente ionica dispersos reteniéndolos con un potencial de igual signo al de la carga de los iones. Se aplica un voltaje de extracion consiguiendo que todos los iones salgan de la fuente simultáneamente. Pasan por un campo electrostático donde adquieren energía cinética que les impulsa a través del tubo de vuelo hacia el detector. Los iones llegan al detector a distinta velocidad en función de M/Z. permite analisis retrospectivos. pero peores prestaciones analisis cuantitativo. Orbitrap: – Elevada resolución de masas (elevada capacidad para resolver interferencias). La resolución es mayor en moléculas de baja M/Z.- La resolución afecta a la sensibilidad.- Mayores prestaciones en el análisis cuantitativo en comparación con TOF. – Elevada exactitud de masas – elevada estabilidad de masas. Aplicabilidad relativa de las tecnicas de ionización: API-Electrospray (LC Y CE): – tecnica mas suave – ideal para compuestos lábiles – interfase cn mayr sensibilidad y aplicabilidad – valida para cmpuestos de baja-media a muy alta polaridad. – permite analisis de compuestos de elevado peso molecular. APCI (LC): -compuestos baja polaridad, no se requiere que esten ionizados en solucion – rquiere compuestos con cierta voilatilidad – buena sensibilidad para compuestos de polaridad y peso molecular intermedios. – complementa a API-electrospray. APPI (LC y CE): -para compuestos de muy baja polaridad (no rquiere que esten ionizados en solucion)  requiere compuestos con cierta volatilidad – posibilita el analis de compuestos apolares

Definiciones (2): Tiempo de retencion: tiempo entre la introduccion de la muestra y aparicion del maximo del pico cromatografico. Volumen de retencion: volumen de FM que eluye entre la introduccion de la muestra y la aparicion del pico cromatogradico. Tiempo muerto : tiempo necesario para que una especie no retenida por FE alcance detector. Ensanchamiento de banda: tiempo transcurrido desde que el soluto alcanza el detector hasta q lo abandona. Area de pico :info cuantitativa Posicion de pico: info cualitativa. forma del pico: alto (sensibilidad) y estrecho (selectividad). Factor de retencion (K): medida de la fortaleza con que una FE retiene a un soluto. Factor de selectividad (alfa): es la relacion entre los tiempos de retencion de 2 componentes. Resolucion cromatogradica (R) : medida cuantitativa del grado de separacion entre dos picos cromatograficos A y B. N platos:  segmentos de la columna donde se establece un equilibrio entre la FE y el analito. Resolucion de una columna :; medida cuantitativa del grado de separacion entre dos picos cromatografricos A y B