Cromatografía Líquida

Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía Líquida

La fase estacionaria requiere materiales estables que no reaccionen con la fase móvil ni se deterioren por su paso o condiciones químicas. Debe tener:

• Resistencia mecánica (presión, flujo, temperatura)
• Resistencia química (pH, oxidantes)

Para cumplir estas características, se usan materiales relativamente inertes como fase estacionaria, generalmente constituida por dos componentes:

• Soporte mecánico o relleno
• Fase ligada

Soporte Mecánico o Relleno

Características:

• Regularidad de tamaño (poca dispersión)
• Tamaño de poro (son generalmente porosos)
• Regularidad de forma

Soportes más frecuentes:

• Gel de sílice o sílica gel (SiO₂ n H₂O)
• Alúmina (Al₂O₃ n H₂O)
• Celulosa
• Poliestireno con grupos funcionales

Gel de Sílice o Sílica Gel (SiO₂ n H₂O)

Es el más usado, presentando en su superficie grupos ligantes Si-O-H. Cumple con las características de estabilidad mecánica y química. Generalmente se usan partículas muy pequeñas (3 – 100 μm de diámetro), clasificadas según su estructura en:

• Partículas Porosas
• Partículas Peliculares
• Mallas monolíticas

Alúmina (Al₂O₃ n H₂O)

También presenta grupos ligantes del tipo Al-O-H. Se usa principalmente en cromatografía de adsorción (al igual que la sílice). Los grupos hidroxilos (OH^–) establecen uniones débiles (dipolo-dipolo, puentes de hidrógeno) con los solutos, produciendo la adsorción.

Celulosa

Se usa como soporte, pero es menos frecuente por su menor estabilidad a condiciones drásticas.

Poliestireno con Grupos Funcionales

Grupos carboxílicos, sulfonatos (aniónicos) y grupos aminos (positivos).

Fase Ligada

En la cromatografía de reparto líquido-líquido (separación por solubilidad), una fase líquida se une químicamente a la superficie del relleno (sílice o alúmina). El relleno actúa como soporte físico de la fase líquida ligada, que es la verdadera fase estacionaria, interactuando con los solutos. La fase ligada son grupos químicos que se unen al soporte.

Fases Móviles más Comunes en Cromatografía Líquida

Solventes químicos con las siguientes características:

• Alta pureza (las impurezas dañan la fase estacionaria)
• Buen disolvente para los compuestos a separar (evitar precipitaciones)
• No reaccionar con los solutos
• Libre de gases (evitar volumen muerto por burbujas)
• Características físicas y químicas definidas (polaridad, pH, temperatura, fuerza iónica, propiedades ópticas)

Elución Isocrática (1 solo solvente)

Se usa un solo solvente como fase móvil durante toda la elución.

Elución en Gradiente

Se usa una mezcla de solventes cuya composición varía durante la elución. Puede ser binaria, terciaria o cuaternaria. Se utiliza para aumentar la velocidad de elución de compuestos retenidos.

Selección del Tipo de Cromatografía

Se basa en las características fisicoquímicas de los analitos (peso molecular, solubilidad, carga iónica, acidez). Con estos datos, se selecciona la fase móvil y estacionaria.

Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

Configuración General de un Sistema HPLC

Los componentes modulares de un cromatógrafo de HPLC son:

• Bomba de alta presión
• Recipientes de la fase móvil (uno o más solventes)
• Unidad de gradiente
• Válvula de inyección de la muestra
• Detector
• Registrador gráfico

Cromatografía de Gases

Método cromatográfico para separar y determinar compuestos volátiles. Una muestra líquida se calienta hasta evaporarse, y sus componentes gaseosos son arrastrados por un gas (fase móvil) a través de una columna (fase estacionaria) donde se separan.

Etapas de la Cromatografía de Gases

1. Evaporación de la muestra líquida.
2. Arrastre de los componentes gaseosos por la fase móvil (N₂, H₂ o He) hacia la columna.
3. Separación en la columna con relleno sólido (cromatografía gas-sólido) o líquido (cromatografía gas-líquido).
4. Separación por diferente retención en la fase estacionaria.
5. Paso de los componentes separados por el detector.
6. Emisión de una señal por el detector.

Cromatógrafo simple

• Programador (flujos de gases, temperatura)
• Inyector de muestras
• Columna de separación
• Horno

Inyector de Muestras

La muestra (líquida o gaseosa) se inyecta en pequeños volúmenes (0.1 – 2 μL). El inyector caliente (T > T ebullición solutos) evapora la muestra, que ingresa a la columna. Hay dos tipos de inyectores: splitless (sin división de flujo) y split (con división de flujo).

Procesos de Separación en GC

Adsorción: Cromatografía gas-sólido (GSC). Retención superficial de compuestos gaseosos sobre la fase estacionaria.

Disolución (Reparto): Cromatografía gas-líquido (GLC). Retención por disolución en la fase líquida.

Separación

Se requiere:

• Retención (k) – tiempo de retención (tr)
• Selectividad (α) – diferencia entre tr
• Eficiencia (N) – capacidad de separación
  N = L / Nth (mm) L= largo columna
  Nth= Número de platos teóricos
  Nth = 5.545 [tr/W_1/2]²

Fase Móvil

Gases de alta pureza y no reactivos:

• Nitrógeno
• Hidrógeno
• Helio

Se usan filtros para humedad y oxígeno.

Columnas

Capilares:

• Largo: 5 – 100 m
• Diámetro interno: 100 – 250 μm

Empacadas:

• Largo: 1 – 5 m
• Diámetro interno: 1 – 4 mm

Efecto de la Temperatura del Horno

La temperatura debe estar levemente por encima del punto de ebullición de los compuestos. Si hay componentes con diferentes puntos de ebullición, se usa un gradiente de temperatura. A menor temperatura, mejor separación, pero mayor tiempo de retención.

Detectores

• Detector de Ionización a la Llama (FID)
• Detector de Conductividad Térmica (TCD)
• Detector de Captura Electrónica (ECD)
• Detector de Quimiluminiscencia (SCD)
• Detector de Emisión Atómica (AES)
• Detector de Masas (MS)