ELECTROFORESIS CAPILAR. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN TOMATE

Introducción

Se escoge el método de electroforesis capilar zonal debido a Su eficiencia separativa, sencillez operativa, grado de automatización y Capacidad de trabajo. La muestra se inserta como una banda en la capilar, Rodeada de disolución tampón.
Cuando se aplica un potencial a través de los Extremos del capilar, los electrolitos de la muestra se trasladan de acuerdo a Su movilidad iónica, separándose en bandas discretas intercaladas en la Disolución tampón.

En la determinación del ácido ascórbico del tomate, la Adición de ácido fosfórico garantiza la estabilidad del ascórbico frente a la Oxidación. La separación se realiza con polarización inversa (entrada cátodo y Salida ánodo). Como tampón de separación, se emplea borato a pH alcalino. En Estas condiciones se produce la separación y detección de aniones y moléculas Neutras en un solo paso. Se trata de una separación basada en la densidad de Carga (q/m).

La detección se realiza por medida directa de la absorbancia UV, es decir, el aumento de absorbancia respecto al fondo correspondiente al Tampón electroforético. La cuantificación se realiza a partir de la calibración Según el método patrón interno.
Esta calibración minimiza el efecto de las Variaciones en las condiciones experimentales, como la falta de Reproducibilidad en la inyección, respuesta de detector… Se añade tanto a las Muestras como a los patrones, una cantidad conocida de un compuesto que no Interfiera el análisis (patrón interno). La medida de los factores de Respuesta, se normaliza con respecto al área del pico del patrón interno. Para Este ensayo se ha elegido el ión ftalato como patrón interno.

Objetivos

– Manejo de un equipo de electroforesis capilar con sistema De inyección de muestra automático.

– Evaluar los parámetros que controlan la separación por Electroforesis capilar zonal.

– Determinar el contenido de vitamina C en muestras de Tomate.

Parte experimental

Para evitar la obturación del capilar, todas las Disoluciones deben filtrarse a través de un filtro de membrana y  desgasificarse mediante ultrasonidos.

Para la preparación de la curva de calibrado: Preparar en Los viales de electroforesis, los patrones a partir de las disoluciones Filtradas de ácido fosfórico, ftalato y ácido ascórbico. Homogenizar y Colocarlas en la bandeja del equipo.

Se prepara la muestra y se lleva al equipo para realizar la Separación.

Cuestiones

1. ¿Qué Es un patrón interno y qué requisitos debe cumplir?

Es un compuesto que no pertenece ningún componente de la Muestra a analizar que se añade siempre ne la misma cantidad a todos los Patrones y muestras a analizar. Se utiliza para corregir la fluctuación de Señal de respuesta del equipo, como errores de detector, de caudal, de control De parámetros del equipo…

Los requisitos son:

– No debe ser un componente de la muestra.

– Zona de señal libre de interferencias de los componentes De la muestra.

– Con carácterísticas físico-químicas similares a los Analitos que se analizan: Deben sufrir con la misma intensidad las Fluctuaciones de señal del equipo.

– No deben reaccionar con ninguno de los componentes de la Muestra.

– Estables.

2. Indicar las variables en un método basado en electroforesis capilar zonal

– Condiciones de inyección: Cantidad de muestra inyectada.

– Dimensión capilar: En un capilar muy corto no dará tiempo A realizarse la separación.

– Voltaje: Si aplicamos un campo grande las moléculas se Moverán más rápidamente.

– Temperatura.

– Tampón: pH, concentración…

– Condiciones de detección.

3. ¿Qué Información cualitativa y cuantitativa puede extraerse de los registros de Electroforesis capilar?

Un electroferograma representa tiempo de migración vs Respuesta del detector. Un compuesto, siempre va a tener un mismo tiempo de Migración. Para determinar la presencia de un determinado compuesto, nos Fijamos si a ese tiempo de migración conocido, hay algún pico (determinación Cualitativa). LA altura o área del pico es proporcional  a la cantidad de analito (determinación Cuantitativa).

4. ¿Por Qué la separación se realiza con tampón borato pH =8?

Se consigue una mayor eficacia y menor tiempo de análisis. ¿?

5. ¿Qué Significa que la introducción de las disoluciones patrón y de las muestras en El capilar se efectúe mediante inyección hidrodinámica?

La introducción de la muestra al capilar mediante una Diferencia de presión entre los dos extremos de la columna. Existen diferentes Formas de producir una presión superior al extremo del capilar en contacto con La disolución de la muestra, como por flujo gravitatorio, aplicación de presión Sobre la muestra, succión…

Este tipo de inyección no depende de la movilidad Electroforética de los solutos ni de la composición de la disolución de la Muestra. El volumen de muestra inyectada viene definido por las dimensiones del Capilar, viscosidad del electrolito, presión aplicada y tiempo.