Fundamento de la Electroforesis de Hemoglobina

La electroforesis de hemoglobina (Hb) es una técnica de separación de moléculas basada en su carga eléctrica. Se fundamenta en el movimiento de moléculas cargadas dentro de un campo eléctrico. Esta técnica es especialmente útil para la caracterización y el análisis de polímeros biológicos cargados, como ácidos nucleicos y proteínas. La migración de las moléculas cargadas en un campo eléctrico depende de su tamaño, forma y carga neta.

Una molécula proteica en solución, a un pH distinto de su punto isoeléctrico, presenta carga neta y, como consecuencia, se mueve bajo la aplicación de un campo eléctrico. Los distintos métodos de electroforesis se diferencian fundamentalmente en el tipo de soporte utilizado.

Material

• Fuente de alimentación
• Cubeta de electroforesis
• Soporte de electroforesis (ej. celogel)
• Aplicador
• Cristal
• Vidrio de reloj
• Micropipeta de 100-1000 μl
• Puntas para micropipeta
• Vaso de precipitados
• Papel de filtro
• Tubos Eppendorf
• Gradilla para tubos Eppendorf
• Erlenmeyer con tapón
• Varilla
• Matraz aforado
• Embudo
• Batea
• Tiras de celogel
• Pinzas
• Pipeta Pasteur
• Cristalizadores

Reactivos

• Solución tampón (buffer) pH 8,8
• Colorante Negro Amido
• Solución transparentadora: 900 ml de metanol + 100 ml de ácido acético
• Decolorante: 50 ml de ácido acético + 800 ml de H₂O

Muestra

• Muestra tratada con el método de Drabkin, previo lavado de los hematíes.
• Reactivo de Drabkin: 1 ml de reactivo de Drabkin + 9 ml de H₂O destilada
• Preparación final: 2,5 ml de reactivo de Drabkin diluido + 10 μl del hemolizado

Preparación de la Muestra

1. Preparación del hemolizado:
   • Centrifugar sangre anticoagulada a 3000 rpm durante 5 minutos.
   • Retirar el plasma.
   • Resuspender los hematíes con 4 ml de suero fisiológico.
   • Centrifugar la suspensión de hematíes a 3000 rpm durante 5 minutos.
   • Retirar el sobrenadante y repetir el lavado de los hematíes 3 veces más, hasta que el sobrenadante sea transparente.
   • Hemolizar los hematíes añadiendo a 1 volumen de hematíes, 1,5 volúmenes de H₂O destilada y 0,5 volúmenes de cloroformo.
   • Homogeneizar la mezcla.
   • Centrifugar la mezcla a 3000 rpm durante 20 minutos.
   • Retirar el sobrenadante (hemolizado).
2. Determinación de la concentración de Hb mediante el método de la cianmetahemoglobina:
   • Utilizar espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm.
   • Datos de ejemplo:
     • Concentración del estándar (Stardar): 20 g/dl
     • Absorbancia del estándar: 0,460
     • Absorbancia de la muestra: 0,341
   • Cálculo de la concentración de la muestra:

     

     Abs muestra (0,341) / Abs estándar (0,460) * Concentración estándar (20 g/dl) = 14,82 g/dl

     

     

3. Dilución de la muestra:
   • Si la concentración del hemolizado es alta (como en el ejemplo, 14,82 g/dl), diluir la muestra para obtener una concentración entre 3-5 g/dl.
   • Cálculo de la dilución (ejemplo para obtener 3 g/dl):

     V1 * C1 = V2 * C2

     V1 = (500 μl * 3 g/dl) / 14,82 g/dl = 101 μl

     

   • En un tubo de hemólisis, mezclar 101 μl del hemolizado y 399 μl de H₂O destilada.

Técnica de Electroforesis de Hemoglobina

1. Preparar la solución buffer diluyendo el concentrado en un matraz con agua. Transferir a una probeta y completar hasta 1 litro con H₂O destilada.
2. Llenar las cubetas de electroforesis al mismo nivel con la solución buffer.
3. Sumergir las tiras de celogel en una batea con solución buffer para asegurar su humectación. La muesca a la derecha y hacia arriba indica la cara mate de la tira.
4. Retirar la tira del buffer y secarla ligeramente con papel de filtro.
5. Montar las tiras sobre el puente de la cubeta. Colocarlas de manera que la esquina cortada quede hacia la derecha y arriba (en el polo negativo) y que los extremos estén en contacto con el tampón en ambos compartimentos. Las tiras deben quedar tensas.
6. Homogeneizar el hemolizado diluido y colocar una pequeña cantidad en un vidrio de reloj.
7. Humedecer el aplicador en la muestra y aplicar el hemolizado a 1 cm de la línea base de la tira.
8. Conectar la fuente de alimentación a 200 V. Introducir el puente en la cubeta y dejar correr la electroforesis durante 60-90 minutos.
9. Transcurrido el tiempo, retirar las tiras e introducirlas en un cristalizador que contenga la solución de Negro Amido. Teñir durante 5 minutos, homogeneizando continuamente.
10. Retirar las tiras y transferirlas a un cristalizador con decolorante. Homogeneizar y dejar hasta que las tiras estén claras. Repetir este paso 3 veces en distintos cristalizadores con decolorante fresco.

Lectura de Resultados

1. Deshidratar las tiras sumergiéndolas en solución transparentadora durante 1 minuto.
2. Después del lavado, colocar las tiras sobre un cristal, asegurándose de que la cara absorbente quede en contacto con el cristal. Las tiras deben quedar bien estiradas. Colocar otro cristal encima para ejercer presión.
3. Analizar la migración de las diferentes hemoglobinas con respecto a la línea de aplicación (línea base).