Espectrofotometría
La espectrofotometría mide la radiación que emana la materia. Se divide en métodos espectroscópicos (medida de intensidad y longitud de onda), que incluyen absorción, emisión y fluorescencia, y métodos no espectroscópicos (propiedades físicas como dispersión, refracción, reflexión y difracción).
Métodos Espectroscópicos
Son técnicas que generan una señal óptica mediante la interacción de la radiación electromagnética con el analito. Se distinguen fenómenos de absorción y emisión. La absorción molecular y atómica dependen del analito, mientras que en la fluorescencia hay absorción seguida de emisión.
Propiedades
Buena sensibilidad, bajo costo, fácil manejo y equipo robusto.
Regiones del Espectro Electromagnético
Cambios de vibración (IR), cambios en la distribución electrónica (UV-rayos X). La espectroscopia UV utiliza luz para provocar transiciones electrónicas, promoviendo un electrón de un orbital de baja energía a uno vacante de alta energía.
Espectrometría de Absorción
La absorción de luz por una sustancia ocurre cuando la luz alcanza un valor para provocar cambios precisos, que pueden ser electrónicos, vibracionales o rotacionales. Los cambios vibracionales son cambios en la distancia entre núcleos, y los rotacionales son cambios de energía cuando las moléculas rotan alrededor de su centro de gravedad. La absorción atómica tiene un gran número de transacciones posibles, incluyendo el subnivel.
Espectro de Absorción Molecular
Es útil para análisis cualitativo y cuantitativo. Variando la longitud de onda dentro de cada zona del espectro, se obtiene el espectro de absorción. La información cualitativa se compara con la muestra de un material de referencia.
Ley de Lambert-Beer
Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, la intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta. La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido a través de una solución.
Propiedades de la Ley de Beer
Propiedad aditiva: en disoluciones con más de una especie, la absorbancia total es la suma de las absorbancias individuales.
Desviaciones
La relación lineal entre absorbancia y paso óptico tiene limitaciones intrínsecas. Al aumentar la concentración, aumenta el número de interacciones, alterando la capacidad de absorción a una longitud de onda determinada. Concentraciones elevadas causan alteraciones significativas en el índice de refracción, lo que a su vez cambia la longitud de onda.
Limitaciones Instrumentales
Mal funcionamiento del espectrofotómetro debido a:
- Fluctuaciones de la fuente.
- Luz errática.
- Respuesta no lineal del sistema electrónico.
Efecto Policromático
En zonas donde existen grandes variaciones de la absorbancia con la longitud de onda, la absortividad varía a lo largo de la banda, causando desviaciones de la ley de Beer.
Limitaciones Químicas
Se originan por reacciones químicas que modifican la concentración de la especie absorbente.
Otras Causas
- Variación de temperatura puede influir en el espectro.
- Efecto fotoquímico.
- El disolvente puede influir.
Selección de Longitud de Onda
Se mide la absorbancia en el entorno más próximo a la longitud de onda máxima.
Efecto Batocrómico/Hipsocrómico
Un grupo auxocromo asociado a una cadena cromófora desplaza la banda de absorción a una longitud más larga y aumenta su intensidad (hipercrómico). El efecto hipocrómico disminuye la intensidad de una banda. Si se desplaza la longitud de onda del máximo de absorción de un cromóforo a una longitud de onda más corta, se produce un efecto hipsocrómico.
Técnicas Espectroscópicas y Equipo
Los fotómetros son instrumentos para medir la absorbancia y emplean filtros de absorción, usándose en la región visible. Sus ventajas son la sencillez, economía, facilidad de mantenimiento y utilidad para realizar análisis. Sus inconvenientes son que no se utilizan espectros de absorción. Los espectrofotómetros pueden usarse en UV, visible e IR, y pueden ser de haz simple o doble haz.
Espectro UV-Vis
Descompone la luz separándola en bandas de longitudes de onda, formando un espectro atravesado. Dispone de radiación constituida por un grupo limitado o continuo de longitudes de onda. La ley de Beer se aplica a radiación monocromática. Anchos de banda estrechos aumentan la sensibilidad y mejoran la selectividad.
Sistema Óptico
- Sistema de radiación (diafragma, rendijas, lentes).
- Sistema de aislamiento de longitud de onda:
- Sistemas no dispersivos: atenúan todas las longitudes de onda excepto la deseada.
- Sistemas dispersos: dispersan la radiación policromática, especialmente las longitudes de onda del espectro.
Espectrofotómetro de Haz Simple
Mide en el rango de 340 a 950 nm, para medidas cuantitativas de absorción en una misma longitud de onda. Mide la absorbancia de la muestra, debiendo medirse primero una muestra de referencia por separado.
Espectrofotómetro de Doble Haz
Compensa todas las fluctuaciones y amplias variaciones de intensidad de la fuente de longitud de onda.
Métodos Cromatográficos
Los métodos de separación se basan en el punto de ebullición, densidad, presión de vapor, punto de fusión y solubilidad. La filtración retiene partículas sólidas, la decantación separa componentes de diferentes fases, la evaporación separa componentes aplicando calor, la sublimación cambia de sólido a vapor, la extracción distribuye solutos entre dos solventes inmiscibles, y la cristalización se realiza a partir de una solución sobresaturada.
Destilación
Separa componentes de mezclas basándose en las diferencias de los puntos de ebullición. Los componentes con baja presión de vapor tendrán un punto de ebullición alto.
Cromatografía
Es un sistema de separación dinámica donde se producen equilibrios de la mezcla a separar con las fases móvil y estacionaria. La fase estacionaria es generalmente sólida, pequeña y con superficie microporosa, empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. La fase móvil es un líquido o gas que transporta los componentes de la mezcla. Se produce una competencia entre la fase móvil y estacionaria, estableciendo un equilibrio entre la concentración del componente en la fase móvil y la concentración en la fase estacionaria. Este proceso se denomina partición.
Ley de Distribución
El valor del coeficiente de distribución es característico de un componente para una fase estacionaria y una fase móvil.
Cromatografía de Exclusión por Tamaño
Utiliza matrices formadas por esferas porosas con un volumen de poros elevado y un diámetro determinado. Se eluyen primero las proteínas mayores y luego las menores. Columnas largas y mayor volumen aseguran una separación de mayor calidad. Las moléculas pequeñas penetran en los conductos y la velocidad de flujo del solvente es menor. Las moléculas grandes no pueden penetrar en los conductos. El soporte son resinas de micropartículas (polímeros hidrofílicos) con un tamaño de poro de 1000-5000 Da. La fase estacionaria es líquida (solvente acuoso) dentro de las micropartículas, y la fase móvil es líquida (solvente acuoso) que atraviesa la columna por espacios intersticiales. Las moléculas grandes avanzan más rápido, mientras que las pequeñas son retenidas.
Cromatografía de Intercambio Iónico
Separa mezclas por pH (disociación de iones). En el interior de la columna está la fase estacionaria, un gel intercambiador de iones. Se eluyen los componentes no unidos a la fase estacionaria y luego los componentes unidos, que se cuantifican por otros métodos. El soporte es una resina de micropartículas, y la fase estacionaria es sólida: carga positiva intercambia aniones (cromatografía aniónica), y carga negativa intercambia cationes (cromatografía catiónica). La fase móvil (líquida) es un solvente que anula la interacción electrostática. Los gradientes de pH cambian la carga de las moléculas de la muestra, y los gradientes iónicos compiten por grupos electrofílicos. Las moléculas con menor carga son más rápidas, desplazadas por la fase móvil, mientras que las moléculas con mayor carga son más lentas, retenidas por los grupos de la fase estacionaria.
Cromatografía de Afinidad
Utiliza esferas de gel recubiertas por un ligando que tiene afinidad por las proteínas a aislar. Las proteínas son retenidas en la superficie de las esferas. Se aumenta la fuerza iónica. El soporte es una matriz de micropartículas, la fase estacionaria es sólida con un ligando unido covalentemente (glicoproteína/proteína A). La fase móvil es una solución que anula la afinidad con el ligando de la fase estacionaria. Las moléculas sin interacción son rápidas, mientras que las moléculas con interacción son lentas y se unen al ligando (elución específica).
Cromatografía de Adsorción
Incluye la cromatografía en capa fina y en papel. La fase estacionaria se sitúa en una placa plana o sobre un papel. La cromatografía en papel utiliza una mezcla de solutos sembrados sobre un papel filtro. La cromatografía en capa fina utiliza una placa recubierta con fase estacionaria con un espesor constante y pequeño. La cromatografía cualitativa calcula el RF, y la cuantitativa estima el área de la mancha. La fase estacionaria en CCF considera la polaridad, tamaño de partícula, diámetro, área superficial y homogeneidad. En adsorción, se utiliza sílica gel, alúmina, celulosa, fluorisil y sulfato de calcio. En exclusión molecular, se utilizan tierras de diatomeas y Sephadex. La fase móvil en CCF considera el precio, pureza, no utilizar mezclas de eluyentes, componentes no volátiles y evitar trazas de metales. Los reveladores son luz UV, vapores de yodo o rocío de agua/H2SO4 1:1. Los generales son H2SO4 y lámpara UV, los selectivos son I2 y ftalato de anilina, y los específicos son ninhidrina, resorcina y difenilamina. Las ventajas son la simplicidad del material, menor tiempo de separación y método simple y reproducible.