Extracción y Purificación de ADN
Introducción
Para el estudio de las propiedades físicoquímicas y biológicas del ADN, es crucial obtener la macromolécula en su estado nativo y altamente polimerizado. Esto implica una serie de pasos para aislar y purificar el ADN de otros componentes celulares.
Pasos de Extracción y Purificación
1. Obtención de Células
El primer paso consiste en obtener células en condiciones apropiadas, libres de materiales que puedan afectar la pureza y calidad del ADN.
2. Lisis Celular
Las células se someten a tratamientos mecánicos, químicos o enzimáticos para romper la pared celular y la membrana, liberando el ADN cromosomal sin afectar su grado de polimerización.
3. Separación de Contaminantes
Una vez liberados los ácidos nucleicos, se procede a separar el ADN de contaminantes como ARN y proteínas.
- Las proteínas se desnaturalizan y eliminan mediante centrifugación.
- La extracción con solventes orgánicos, como el fenol y el cloroformo, elimina polipéptidos remanentes.
- La precipitación con etanol o isopropanol permite la eliminación de polisacáridos, iones y otros compuestos solubles en agua.
- El ARN se elimina mediante degradación enzimática con ARNasa.
4. Prevención de la Degradación del ADN
Para evitar la degradación del ADN por ADNasas, se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas como el SDS y quelantes de iones divalentes como el EDTA.
Consideraciones Específicas
La extracción de ADN puede variar en dificultad según el microorganismo. Factores como la composición de la pared celular, la presencia de polisacáridos capsulares y cubiertas lipídicas, y el grado de asociación ADN-proteína pueden influir en la purificación. Es recomendable realizar ensayos de susceptibilidad a la lisis con diferentes detergentes y enzimas para optimizar el proceso.
Reactivos Comunes
- Solución Salina-EDTA: Inhibe la actividad de las ADNasas.
- Lauril Sulfato de Sodio (SDS): Detergente aniónico que lisa la mayoría de las células no metabolizantes.
- Lisozima: Enzima que lisa células resistentes a detergentes.
- Perclorato de Sodio: Ayuda a disociar proteínas unidas al ADN.
- Fenol: Desnaturaliza y precipita proteínas.
- Cloroformo-Isoamílico: Desnaturaliza proteínas y facilita la separación de fases.
- Etanol/Isopropanol: Precipita ácidos nucleicos.
Conclusión
La extracción y purificación de ADN son procesos esenciales para el estudio de esta molécula fundamental. La elección de los protocolos y reactivos adecuados depende de las características del microorganismo y los objetivos del estudio.