Espectrofotometría

La espectrofotometría es un método instrumental analítico que permite cuantificar y caracterizar un compuesto en solución. Se fundamenta en la propiedad de los átomos y moléculas de absorber y emitir energía dentro del espectro electromagnético.

Radiaciones Electromagnéticas

Longitud de Onda

Radiación electromagnética

Modelo corpuscular -) fotones E=h c/ λ

• λ: longitud de onda
• c: velocidad de la luz 299.792.458 m/s
• h: constante de Planck 6,626069 * 10E-34 J x s
• E: energía

Relación inversamente proporcional

A menor longitud de onda, la radiación es de mayor energía.

Absorción

La luz es absorbida por átomos, iones o moléculas, alcanzando un estado excitado de mayor energía. La luz es absorbida por una sustancia sólo cuando la energía corresponda a una necesidad energética o de transición de la sustancia.

Los cambios a producirse en la sustancia pueden ser de carácter: electrónico, vibracional o rotacional.

La absorción de radiación por parte de un determinado material o sustancia depende de la estructura y composición química de las moléculas y átomos que la componen. Las estructuras químicas absorben radiación de longitudes de onda determinadas.

Emisión

Liberación de un fotón por un átomo, ión o molécula, alcanzando un estado de menor energía.

Curvas de Calibración

A = K x c. Luego, la concentración de una solución está dada por c = A / K; lo cual significa que para calcular dicha concentración debemos conocer la absorbancia de la solución y el valor del factor K (e x 1), que es una constante característica para cada sustancia. (c) concentración igual a absorbancia (A) partido por el factor de calibración (K)

• Determinar los límites de concentración que obedecen la ley de Lambert-Beer (linealidad entre absorbancia y concentración).
• Obtener el valor de K mediante el cálculo de la pendiente de la recta.
• Alternativamente, calcular el valor de K para cada punto de la recta (K = A/c) y luego, obtener el valor promedio o K promedio.

Enzimología

Enzimas

Las enzimas son agentes catalizadores de los sistemas biológicos. Todas las enzimas son proteínas excepto las ribozimas. Son altamente específicas y eficientes. Muchas enzimas presentan regulación de su actividad.

Sustrato

Molécula sobre la cual actúa una enzima. El sustrato se une al sitio activo de la enzima y se forma un complejo enzima-sustrato. El sustrato por acción de la enzima es transformado en producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato. La ecuación general es la siguiente:

E + S ⇌ ES → EP ⇌ E + P

Velocidad Enzimática

Se determina en función de:

• La cantidad de desaparición de sustrato por unidad de tiempo.
• La cantidad de producto formado por unidad de tiempo.

Además depende de la cantidad de enzima activa presente en la reacción.

Velocidad de la Reacción

Cuando la concentración de sustrato es saturante, la totalidad de la enzima se encuentra formando el complejo enzima-sustrato y la velocidad de la reacción es máxima y directamente proporcional a la concentración total de enzima presente en el medio.

Determinación de Velocidades de Reacción

• Sustratos y productos de la reacción enzimática.
• Métodos analíticos para su cuantificación.
• El método fotométrico debe obedecer a la ley de Lambert-Beer.
• Curva de calibración para el método de medición.

Fórmula para calcular la pendiente de la parte lineal de la curva (actividad enzimática inicial): v=a/b

• Unidad enzimática: U=micromoles producto/min
• Actividad Enzimática: U/ml enzima=micromoles producto/min x ml enzima pura
• Actividad específica: U/mg proteínas=micromoles producto/min x mg de proteína
• Velocidad de reacción: Cantidad de producto formado/unidad de tiempo ó cantidad de sustrato desaparecido/ unidad de tiempo

Cuando la concentración de sustrato es saturante, la totalidad de la enzima se encuentra formando el complejo enzima-sustrato y la velocidad de la reacción es máxima y directamente proporcional a la concentración total de enzima presente en el medio.

Factores que Influencian la Reacción Enzimática

• pH
• Temperatura
• Concentración de sustrato
• Presencia de inhibidores

pH: En los ensayos enzimáticos el pH debe mantenerse constante durante la incubación (amortiguador) ya que la velocidad de una reacción enzimática está influenciada por el pH del medio de incubación.

Temperatura: A medida que la temperatura de incubación aumenta, la actividad de la enzima aumenta, hasta alcanzar la denominada temperatura óptima experimental. A temperaturas superiores, el proceso de desnaturalización se hace cada vez más evidente, hasta producirse una total inactivación de la enzima.

Blanco Sustrato

Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de sustrato es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua.

Blanco Enzima

Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de enzima es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua.

Tiempo Cero

Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, necesarios para la determinación de la actividad de la enzima pero, la reacción enzimática se detiene en el momento mismo de completar la adición de los componentes del ensayo, agregando el agente inactivador inmediatamente después de completar la adición del último componente de la mezcla de reacción.

La velocidad de la reacción enzimática se determina en función de la cantidad de desaparición de sustrato o de la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.

Principios y Leyes de la Fotometría

Lambert (1760): I_t = I_o x 10^{-e l}

Beer (1852): Ley de Lambert-Beer, que relaciona la disminución de la intensidad de la luz transmitida con la concentración y el espesor o largo de una solución, lo que puede expresarse matemáticamente como: I_t = I_o x 10^{-e l c}

En sentido estricto, esta ley se cumple rigurosamente cuando se utiliza una radiación monocromática. Si dividimos ambos términos de la ecuación por I_o tenemos: I_t / I_o = 10^{-e l c}

La razón I_t/I_o se llama transmisión o transparencia del sistema, por lo tanto, cuando la luz transmitida es igual a la luz incidente, el valor de esta razón es igual a 1,0, lo que significa que el sistema es absolutamente transparente. Si descartamos, por medio de un control adecuado, o blanco, la luz absorbida por el solvente y las paredes del continente de la solución, nos referiremos solamente a la transparencia del soluto disuelto que se desea medir. En este caso se habla de transmitancia.

Lo contrario a transmisión o transparencia se denomina opacidad y corresponde al valor recíproco de ésta, es decir, I_o/I_t. Tomando logaritmos en ambos miembros de la ecuación y reordenándola algebraicamente, se obtiene: log I_o /I_t = e l c

El logaritmo de la opacidad (log I_o/I_t) se denomina absorción o extinción. Estos términos no son actualmente usados y se prefieren los términos de densidad óptica (DO) o absorbancia (A):

DO = A = e l c