Preparación de Material, Reactivos y Muestras. Seguridad en el Laboratorio

1. Enfoque general de la asignatura
2. El material biológico y el diseño experimental
3. Material de laboratorio
4. Preparación de reactivos: disoluciones, diluciones y disoluciones tampón
5. Esterilización
6. Métodos generales de procesamiento de muestras biológicas: Homogeneización y Centrifugación
7. Seguridad en el laboratorio

1. Enfoque General de la Asignatura

El avance de la investigación y la experimentación ha transcurrido paralelo al desarrollo de potentes técnicas y métodos experimentales que han permitido separar, aislar, purificar moléculas biológicas y estudiar sus propiedades. De ahí el interés de esta asignatura, donde se establecen los fundamentos necesarios para saber aplicar determinadas técnicas experimentales básicas, útiles en todas las áreas de la Biología.

Se puede distinguir entre dos tipos de técnicas:

• Técnicas de separación: centrifugación, cromatografía, electroforesis.
• Técnicas detección y cuantificación: espectrofotometría, espectrofluorimetría, técnicas que usan radioisótopos y técnicas inmunoquímicas.

Además, las técnicas pueden tener carácter preparativo o analítico.

Las técnicas preparativas son aquellas que tienen como objetivo obtener una muestra enriquecida en una determinada molécula de interés (eliminando moléculas “contaminantes”), procesando cantidades relativamente grandes de muestra. Generalmente, son técnicas poco específicas que se llevan a cabo en las primeras etapas de purificación o aislamiento de un compuesto. Ejemplos: filtración o diálisis, precipitaciones con sales o compuestos orgánicos y la centrifugación, cromatografía y electroforesis en la mayoría de sus aplicaciones, aunque tienen variantes con carácter analítico.

Las técnicas analíticas son aquellas que procesan una discreta cantidad de muestra para determinar la concentración, reactividad u otras características (concentración, actividad enzimática, estructura, peso molecular, punto isoeléctrico) de una determinada molécula de interés contenida en la muestra. Suelen ser técnicas específicas que se utilizan al final de los procesos de purificación o aislamiento cuando la muestra ya ha sido sometida a alguna técnica preparativa previa. Son técnicas analíticas la espectrofotometría, espectrofluorimetría, las técnicas que usan radioisótopos y algunos tipos de cromatografías como la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

No obstante, hay técnicas que pueden utilizarse indistintamente, y según la ocasión, con fines preparativos o analíticos.

2. El Material Biológico y el Diseño Experimental

El material biológico objeto de estudio puede proceder prácticamente de cualquier forma de vida, desde organismos unicelulares (bacterias, levaduras y otros microorganismos) hasta animales o plantas superiores (organismos pluricelulares), incluyendo el material de origen humano.

La experimentación puede realizarse según dos grandes modelos:

• experimentación in vivo, o
• experimentación in vitro.

Los estudios in vivo se realizan sobre organismos vivos mantenidos en condiciones ambientales controladas (ratas, ratones, conejos, primates, peces, ganado u otros organismos animales y vegetales con interés económico). En esos estudios se analiza el efecto de un determinado factor sobre el comportamiento de un determinado sistema molecular con una localización determinada en el organismo. El problema es que en el comportamiento observado en ese sistema molecular pueden existir influencias de otras células, tejidos u órganos del mismo organismo, por lo que, a veces, es difícil determinar si el efecto observado es debido realmente al factor externo aplicado. Las principales aplicaciones de los estudios in vivo son: la investigación médica y veterinaria, la fabricación de vacunas, anticuerpos y hormonas, estudios de drogas y tóxicos, estudios sobre el metabolismo de diferentes sustancias y situaciones.

En la actualidad la experimentación con animales se encuentra regulada por una legislación autonómica, nacional e internacional. El Comité de Ética o Bioética de la Universidad de Jaén se asegura de que los experimentos realizados con animales cumplan dicha legislación, se encarga de proteger los derechos y el bienestar de los animales mientras se mantienen en el edificio Animalario (A1) y también durante la experimentación, para minimizar el sufrimiento o los sacrificios innecesarios (se debe utilizar el mínimo número de animales que sea posible).

Los estudios in vitro se llevan a cabo con un único tipo de células, organismo o microorganismo aislado de su entorno habitual y mantenido en condiciones de esterilidad para evitar contaminaciones. Con estos experimentos se consigue un gran control de las variables ambientales y se reduce la necesidad de sacrificar animales, otra ventaja es que con este tipo de estudios se puede analizar de forma muy fiable el efecto de una determinada sustancia sobre un sistema molecular concreto evitándose las influencias de células o tejidos cercanos, el inconveniente es que los resultados obtenidos no siempre son extrapolables a lo que ocurre in vivo.

En la actualidad, los enfoques in vivo e in vitro son complementarios, de manera que el conocimiento de un determinado proceso bioquímico es el resultado de la integración de los resultados obtenidos mediante ambos enfoques.

Por lo tanto, los abordajes experimentales suelen realizarse combinando ambos modelos y comprenden las siguientes etapas:

• Estudios moleculares llevados a cabo con el sistema molecular purificado y ensayando su comportamiento in vitro.
• estudios con orgánulos celulares donde se encuentra el sistema de interés. Estos orgánulos se aislan de las células y del resto de orgánulos que los acompañan en ellas.
• estudios con cultivos in vitro de los tejidos o células donde se encuentra el sistema analizado. A veces, el tejido de interés no se puede mantener en cultivo, en esos casos se utilizan tejidos similares
• estudios en órganos aislados, en los que se estudia el comportamiento del sistema molecular aislado del resto de tejidos u órganos del organismo
• estudios realizados en un animal completo, en los que se estudia el comportamiento de un sistema molecular ubicado en un órgano o tejido determinado dentro del organismo completo (in vivo).

Normalmente, cuando se descubre una molécula nueva o fármaco para el tratamiento de enfermedades, se realizan ensayos en las etapas anteriormente indicadas con el objeto de analizar los efectos de la sustancia descubierta antes de ser aplicada en humanos.

Otra modalidad, son los estudios ex vivo, en los que células o tejidos extraídos del ser vivo se mantienen con vida fuera de él en condiciones lo más parecidas a las fisiológicas y posteriormente se devuelven al organismo vivo tras realizar algún tratamiento u operación.

3. Material de Laboratorio

Hay una gran variedad de materiales y aparatos que suelen estar presentes y ser necesarios en un laboratorio de tipo químico y biológico. Estos materiales sirven para contener o fabricar disoluciones, para preparar muestras, para hacer mediciones de volumen, para pesar los reactivos, determinar valores de pH, agitar disoluciones, etc. Muchos de estos materiales se muestran y explican en las animaciones interactivas que puedes encontrar en la Plataforma ILIAS (partición de la primera parte de la asignatura).

El material de laboratorio puede ser de vidrio o de plástico y se puede clasificar en:

• material volumétrico o calibrado y
• material no volumétrico o no calibrado.

Únicamente el material volumétrico o calibrado es adecuado para realizar mediciones exactas de volúmenes. Dentro de este grupo caben destacar los siguientes materiales: pipeta graduada, micropipeta, probeta, bureta, matraz aforado. Para reconocer un instrumento volumétrico calibrado por el fabricante, se puede observar impresa una temperatura (20ºC) en el instrumento, indicativo de que el volumen ha sido ajustado con agua pura a una temperatura de 20º C.

Dentro del material no volumétrico no calibrado destacaremos el vaso de precipitados y el matraz Erlenmeyer. Estos materiales se utilizan para contener líquidos, agitar disoluciones, realizar trasvases, etc, pero nunca para medir volúmenes con precisión.

Hay diferentes tipos de tubos: de ensayo, de centrífuga, de cultivo, unos serán calibrados y otros no.

Sin embargo, en un laboratorio se dispone de otros materiales como:

• Soportes: gradilla, pinzas, aro, trípode.
• Recipientes: matraz de balón, frasco lavador, botella, desecador, cristalizador, vidrio de reloj, placas de Petri.
• Embudos: cónico, Gibson, Buchner.
• Dispositivos de succión: matraz kitasato, pipeta Pasteur, propipeta.
• Cucharillas y espátulas
• Mecheros: de alcohol, de gas (Bunsen).

Como aparataje básico de laboratorio se podría nombrar:

• Balanzas: de contrapeso, granatarias, analíticas, microbalanzas.
• Medidores de pH o pH-metros.
• Agitadores: agitador orbital o basculante, agitador magnético, vórtex o agitador de tubos.
• Instrumentos termostáticos: baño termostático, termobloque, estufas, hornos.
• Equipos de conservación de reactivos y muestras: frigoríficos (4 ºC), congeladores (de -20º C y -80 ºC).
• Homogeneizadores: Dispersador, sonicador, Potter-Elvehjem, mortero
• Purificadores de agua

Otros instrumentos de laboratorio no son tan comunes, pero son necesarios en función de la especialidad analítica del laboratorio. Así se pueden citar instrumentos tales como: espectrofotómetros, centrífugas, microscopios, equipos de electroforesis, instrumentos de cromatografía, termocicladores, etc.

Los materiales de laboratorio deben manejarse con cuidado, particularmente aquellos que son frágiles (vidrio, cerámica, etc). También hay que tener presente la limpieza y conservación de los materiales. Cuando se trata de material lavable, es conveniente enjuagarlo con agua destilada después de su lavado con agua del grifo y jabón, para que no queden restos calizos al secarse el agua corriente.

4. Preparación de Reactivos: Disoluciones, Diluciones y Disoluciones Tampón

Los productos químicos de un laboratorio pueden encontrarse como se suministran comercialmente o preparados en disolución por el trabajador.

En el etiquetado de los productos químicos comerciales podemos encontrar la siguiente información útil:

• Nombre y fórmula química del producto.
• Características físicas y químicas (riqueza, densidad, peso molecular).
• Temperatura recomendada de conservación.
• Advertencias de seguridad.

Disoluciones

Una disolución es una mezcla homogénea a nivel molecular de dos o más sustancias. En una disolución se distinguen dos componentes: el disolvente y el/los solutos. Un disolvente es una sustancia que permite la dispersión de los solutos en su seno. El soluto es la sustancia que se dispersa en el seno de un disolvente. Las disoluciones que habitualmente se emplean en los laboratorios están constituidas por disolventes líquidos y los solutos pueden ser sustancias sólidas (por ejemplo, una sal) o líquidas (por ejemplo, un alcohol).

Los disolventes líquidos pueden ser polares o apolares.

El disolvente polar más común utilizado en un laboratorio es el agua (destilada o ultrapura= milli Q). Los destiladores proporcionan agua destilada y los sistemas de filtrado y ósmosis inversa generan agua ultrapura.

Los compuestos polares se disuelven en disolventes polares, como el agua, sin embargo, los compuestos apolares suelen solubles en disolventes apolares que normalmente son compuestos orgánicos. Se han de tener ciertas precauciones a la hora de utilizar disolventes orgánicos, ya que pueden ser tóxicos por inhalación o contacto con la piel, pueden corroer ciertos materiales plásticos y suelen ser muy contaminantes.

Cuando se usa un compuesto en disolución en el laboratorio es necesario tener una referencia de la cantidad de compuesto que hay con respecto al volumen de disolución, es decir, tener una referencia de la concentración del compuesto.

La concentración de un compuesto se puede expresar en diferentes unidades: molaridad (M), normalidad (N), molalidad (m), concentración porcentual (% p/v, % v/v ó % p/p) o masa por unidad de volumen (kg/l, mg/ml, g/l, etc.)

Diluciones

Debemos diferenciar entre los términos “disolución” y “dilución”. Una dilución consiste en añadir disolvente a una disolución previa. La relación existente entre la disolución concentrada y la diluida preparada a partir de la primera es la siguiente:

C1 x V1= C2 x V2

C1 y V1 son la concentración y el volumen de la disolución concentrada de partida y C2 y V2 los de la disolución diluida. Cualquier unidad de expresión de concentración (M, N, %, mg/ml, etc.) y de volumen (l, ml, cc, etc.) puede aplicarse en esta ecuación, siempre y cuando la unidad de concentración empleada para ambas C sea la misma. De igual modo, la unidad de volumen utilizada debe ser la misma en ambos V.

Otra forma muy común de expresar las diluciones es mediante fracciones o mediante un número precedido del símbolo “:”, de cualquiera de estas dos maneras se indica cuánto más está diluida una disolución con respecto a otra (por ejemplo: 1/2; 1/10, 1/20, 1/FD). La abreviatura FD significa factor de dilución (veces de dilución). El factor de dilución nos permite calcular el volumen que hay que tomar de una disolución concentrada para preparar un determinado volumen de otra disolución diluida un determinado número de veces. Para ello hay que tener presente la siguiente relación:

V2/V1 = FD

Disoluciones Tampón

En muchas ocasiones las disoluciones de laboratorio deben tener una determinada concentración de protones o pH ya que este parámetro influye en la estructura y reactividad de las sustancias. El pH es un parámetro indicativo de la concentración de protones que tiene una disolución (pH = – log [H+]). Para mantener el pH en un determinado valor se añade a la disolución un compuesto tampón (en inglés: buffer). Los tampones están constituidos por un par ácido débil-base conjugada en equilibrio químico. Un ácido es una sustancia con capacidad de liberar protones y una base de aceptarlos. Cuando en una disolución se establece un par ácido débil-base conjugada, si se añadieran protones a la disolución (por ejemplo, añadiendo ácido clorhídrico), la base conjugada los captaría y parte de sus moléculas se convertirían en ácido débil. Si se ejerciera una acción que provocara la disminución de la concentración de protones de la disolución (por ejemplo, con sosa), la forma ácida del compuesto liberaría protones convirtiéndose en base conjugada. De este modo, la concentración de protones en la disolución, esto es, el pH, variaría relativamente poco si se añadieran ácidos o bases a la disolución.

Se ha comentado anteriormente que un par ácido débil – base conjugada forman un equilibrio químico. En todo equilibrio químico cumple la ley de acción de masas, que establece que en una reacción química reversible en equilibrio la relación entre las concentraciones de los sustratos y los productos tiene un valor fijo (Keq), característico de cada reacción. La constante de equilibrio en un par ácido – base conjugada se denomina Ka y, de forma análoga al concepto de pH, se puede expresar también en forma de pKa (valor de pH al cual el tampón posee su máximo poder tamponante).

Dependiendo del pH al que se quiera estabilizar la disolución objeto de estudio se elige un sistema tampón u otro. El criterio más acertado consiste en elegir aquel tampón cuyo valor de pKa sea lo más próximo posible al valor de pH que se quiera establecer en la disolución objeto de estudio. Por norma se considera que un sistema tampón es eficaz para mantener el pH en un rango que abarca una unidad por encima y por debajo de su pKa.

La ecuación de Henderson-Hasselbalch es una fórmula química que relaciona el pH que se desea establecer en una disolución con el pKa del par ácido-base conjugada empleado y las concentraciones de ácido y de base conjugada existentes en la disolución. Esta ecuación es útil para fabricar disoluciones tamponadas con un determinado valor pH, ya que permite saber qué cantidad de forma ácida y de forma básica del compuesto tamponante hay que pesar y mezclar para conseguir el pH deseado.

5. Esterilización

En muchas ocasiones se necesita que las disoluciones, materiales e incluso los recintos sean estériles, es decir, que no contengan ningún microorganismo vivo (bacterias, hongos, esporas, etc).

Existen diversos procedimientos para la esterilización microbiológica. Hay procedimientos que son adecuados para esterilizar un determinado tipo de material y otros no. Los sistemas de esterilización se pueden clasificar en métodos físicos y químicos.

• Métodos físicos:
  • Flameado: Consiste en calentar un objeto con una llama hasta la incandescencia. También se puede impregnar el objeto con un líquido inflamable y prender fuego hasta su extinción. El instrumento que se suele utilizar es el mechero Bunsen.
  • Autoclavado: Consiste en exponer el material a esterilizar a alta temperatura y alta presión de vapor de agua. Por lo general, el autoclavado consiste en someter los materiales a 121 ºC y 103 kPa (kilopascales) de 15 a 20 min. El instrumento que se utiliza es el autoclave.
  • Calor seco: Se expone el material a temperaturas muy elevadas durante varias horas. Se utilizan estufas u hornos de esterilización.
  • Radiaciones: Exposición a radiaciones electromagnéticas de alta energía, como la luz ultravioleta (UV) o rayos gamma.
  • Filtración: Indicado para esterilizar líquidos y disoluciones sensibles al calor. Consiste en forzar el paso de un líquido a través de una membrana con poros tan pequeños que no permitan el paso de ningún microorganismo.
• Métodos químicos: Exposición de los materiales a compuestos gaseosos o líquidos letales para los microorganismos como, por ejemplo, el peróxido de hidrógeno o el óxido de etileno.

Por otro lado, para trabajar en el laboratorio en un ambiente estéril es recomendable hacerlo en cámaras de flujo laminar, en las que el aire que entra en la cabina es filtrado para eliminar microorganismos. Además, las cámaras de flujo laminar suelen tener una lámpara de luz UV para esterilizar el recinto interno de la misma. Por supuesto, al utilizar la cámara la lámpara UV debe estar apagada para evitar quemaduras en la piel.

Hay dos tipos:

• Cámara de flujo laminar horizontal: En esta cámara, el aire sale horizontalmente desde el fondo hacia el operario evitando así que los microorganismos entren en la cámara. Este tipo de cámaras se usan para evitar que se contaminen con aire del exterior los materiales que se manejan en su interior.
• Cámara de flujo laminar vertical: En esta cámara, el aire sale verticalmente desde el techo de la cámara hacia abajo evitando así que los materiales que se manejan en su interior se contaminen con aire externo, además, ese sistema evita que los organismos infecciosos puedan llegar al operario. Este tipo de cámaras se usan para la manipulación de materiales infecciosos o tóxicos para el usuario.

6. Métodos Generales de Procesamiento de Muestras Biológicas: Homogeneización y Centrifugación

Homogeneización

Suele ser el primer paso para el análisis de una muestra biológica y consiste en un proceso de rotura o lisis celular y posterior disolución o recogida de su contenido en un medio adecuado (tamponante), que se denomina tampón de homogeneización.

La homogeneización puede ser:

• Parcial: solo se rompen las cubiertas celulares (no los orgánulos) y permite la obtención de orgánulos celulares intactos. Como instrumento de rotura parcial suele utilizarse el potter Elvehjem, que rompe las cubiertas celulares mediante movimientos de cizallamiento.
• Completa o total: se rompen tanto las cubiertas de las células como los orgánulos, liberándose todos los componentes moleculares de la muestra. Los métodos de rotura celular total pueden ser más o menos agresivos dependiendo de la resistencia de las células a la rotura. Son métodos más agresivos la sonicación, la alternancia de ciclos de congelación-descongelación y la aplicación de altas presiones. Estos métodos se aplican a materiales biológicos que poseen pared celular (bacterias, levaduras o células vegetales). Más suaves son la trituración y la pulverización, que se utilizan fundamentalmente para homogeneizar tejidos animales.

(En la diapositiva número 36 se relacionan diferentes de métodos de rotura con el instrumento utilizado para llevarlo a cabo).

El medio de homogeneización o tampón de homogeneización debe contener los compuestos necesarios para mantener las propiedades biológicas de las moléculas u orgánulos que se desean analizar, para ello es importante controlar el pH al que se va a someter a las muestras mediante un sistema tampón (de ahí el nombre de tampón de homogeneización), la fuerza iónica o concentración de la forma ácida y de la base conjugada del sistema tampón, valorar la necesidad de incorporar inhibidores de enzimas degradativas o inhibidores de proteasas, agentes quelantes, agentes osmóticos, detergentes, etc.

Centrifugación

Tras el proceso de homogeneización de una muestra biológica, el homogenado se somete a una centrifugación para descartar partículas que puedan interferir en los procesos analíticos y seleccionar la fracción en la que se encuentra la sustancia de interés. La centrifugación consiste en someter una disolución a un movimiento rotatorio para así impulsar el movimiento de las partículas disueltas por la fuerza centrífuga, desplazándolas en sentido perpendicular y opuesto al eje de rotación. Las partículas sometidas a centrifugación se desplazarán a mayor velocidad en el seno de la disolución cuanto mayor sea su coeficiente de sedimentación (S), un parámetro en el que se integran la masa, el volumen y la forma de la partícula, entre otros. Normalmente, tras una centrifugación se obtienen dos fracciones: el precipitado y el sobrenadante.

Las centrífugas son los instrumentos de laboratorio en los que se realizan los procesos de centrifugación. Las centrífugas pueden ser instrumentos más o menos sofisticados, ello depende de la capacidad de carga y de la velocidad que puedan alcanzar, de si realizan vacío o no, de si son refrigeradas o no, etc. Así, podemos distinguir desde microfugas (las más sencillas) hasta las ultracentrífugas (las más complejas), pasando por las centrífugas de mesa (complejidad intermedia).

Las centrífugas contienen una pieza en muchas ocasiones intercambiable llamada rotor, con orificios en los que se alojan ajustadamente los tubos con las muestras. El rotor se encaja en un eje de rotación (vástago) que transmite el movimiento de giro generado por un motor. En función de la posición que adopten los tubos en el rotor se puede distinguir entre rotores basculantes y de ángulo fijo, estos últimos pueden ser verticales y angulares. Los rotores basculantes tienen un sistema de bisagras que permite a los tubos adoptar una posición horizontal cuando el rotor está girando y vertical cuando el rotor está quieto. En los rotores de ángulo fijo, los tubos permanecen en la misma posición con el rotor en reposo o en movimiento.

La velocidad de una centrifugación puede expresarse en dos unidades:

• Revoluciones por Minuto (RPM), es decir, el número de vueltas que da el rotor por minuto.
• Fuerza Centrífuga Relativa (RCF, en inglés Relative Centrifuge Force) que indica cuánto mayor es la fuerza centrífuga aplicada sobre la partícula sometida a centrifugación con respecto a la fuerza de la gravedad. Los valores de RCF se expresan con la unidad “xg”.

La siguiente ecuación relaciona RPM y RCF:

RCF = 1,12 · 10 -5 (RPM)2 · r(cm)

Donde “r” es el radio de giro, la distancia desde el eje de giro hasta el punto en rotación pudiendo distinguirse un radio mínimo, medio y máximo (por convenio, utilizaremos el radio máximo en nuestros cálculos). Como se puede entender de esta ecuación, ante una misma velocidad de rotación (RPM) la fuerza centrífuga relativa será mayor cuanto más alejado esté el objeto en rotación con respecto al eje de giro (mayor radio). Con el uso del parámetro RCF se pueden realizar centrifugaciones de igual intensidad en diferentes rotores. Supongamos dos rotores, A y B, de dimensiones diferentes. Si se desea centrifugar a la misma intensidad con ambos rotores, por ejemplo a 1000xg, habrá que imprimir al rotor A una velocidad RPM diferente que al B.

Las centrífugas son instrumentos muy peligrosos y hay que tener en cuenta ciertas precauciones con el objeto de utilizarlas de forma segura:

• Colocar los tubos guardando simetría entre ellos y el eje de giro, además, han de estar equilibrados en peso.
• No llenar los tubos en exceso para que no haya derrames durante el proceso de centrifugación
• Los tubos deben ser adecuados para cada tipo de rotor (que queden bien ajustados)
• Mantener limpios y secos la cámara de centrifugación y los rotores
• Utilizar tubos adecuados que no se deterioren por el tipo de disolvente utilizado o la velocidad de centrifugación
• No abrir la tapa de la centrífuga hasta que el rotor esté completamente parado.

7. Seguridad en el Laboratorio

El trabajo en el laboratorio es una actividad que entraña riesgos. En los laboratorios homologados se exige tener un equipamiento y un reglamento de seguridad que todo personal debe conocer, saber utilizar y cumplir para no poner en riesgo los resultados del experimento, la salud e integridad del investigador o del resto de personal que trabaja en el laboratorio. Las normas de seguridad pueden ser más o menos exigentes dependiendo de los reactivos, muestras e instrumentos que se utilicen en el laboratorio. No obstante, hay unas normas básicas estrictas, para todo tipo de laboratorios. Por otro lado, hay normas que sin estar homologadamente establecidas se deben cumplir por sentido común, cortesía y seguridad, etc. También es recomendable conocer algunas actuaciones de primeros auxilios y emergencias.

La Universidad de Jaén dispone de un Servicio de Prevención, donde puede encontrar información muy útil sobre Seguridad en el trabajo, particularmente en el laboratorio. También se realizan cursos de formación para el profesorado y para los alumnos, simulacros de incendio en los diferentes edificios docentes, etc.

A continuación vamos a comentar algunas de las precauciones que se deben tener en cuenta en un laboratorio: