Introducción a la Observación de Bacterias

Las bacterias son microorganismos procariotas, caracterizados por poseer una pared celular y carecer de un núcleo definido. La célula bacteriana presenta estructuras constantes como la pared celular, membrana citoplasmática, citoplasma y material nuclear. También puede tener estructuras facultativas como fimbrias o pili, flagelos y cápsula.

La visualización de bacterias al microscopio óptico puede realizarse directamente (en vivo) o mediante técnicas de tinción (muestras fijadas y teñidas). La elección del método depende de las características que se deseen estudiar.

Clasificación de Bacterias según su Observación Microscópica

Las bacterias se pueden clasificar según varios criterios observados al microscopio:

1. Morfología:
   • Forma redonda: Cocos
   • Formas alargadas: Bacilos
   • Formas intermedias: Cocobacilos
   • Formas curvadas: Vibrio, Espirilo o Espiroquetas
2. Agrupación (en cocos):
   • Parejas: Diplococos
   • Cadena: Estreptococos
   • Racimo: Estafilococos
   • Masas cúbicas: Sarcinas
3. Movilidad:
   • Inmóviles
   • Móviles (por cilios o flagelos)

Métodos de Examen Microscópico

1. Examen en Fresco (Montaje Húmedo)

Consiste en colocar la muestra entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Si la muestra es sólida, se realiza una suspensión en agua destilada o solución salina fisiológica (SSF) estéril. Se observa con el condensador bajo y el objetivo seco fuerte (40X).

Este método permite detectar bacterias directamente, cuantificar su concentración, observar su morfología y determinar su movilidad. Sin embargo, para observar la estructura interna y externa, es necesario teñirlas.

2. Examen por Tinción

Las tinciones matan a los microorganismos, pero permiten una mejor visualización debido al bajo índice de refracción de las bacterias. Se utilizan técnicas para minimizar las diferencias con las células vivas. Las preparaciones teñidas se observan con el condensador alto y el objetivo de inmersión (100X).

Un colorante es una sustancia que comunica su color a otras estructuras. Pueden ser:

• Ácidos: Tiñen estructuras básicas (citoplasma). Ejemplos: eosina, ácido pícrico.
• Básicos: Tiñen estructuras ácidas (núcleo). Ejemplos: azul de metileno, verde malaquita, fucsina, violeta de genciana, safranina.
• Neutros: Tiñen tanto estructuras ácidas como básicas. Ejemplo: eosinato de azul de metileno.

En microbiología se utilizan principalmente colorantes básicos debido a la basofilia del citoplasma bacteriano (rico en ARN). A menudo se añade un mordiente, una sustancia que refuerza la acción del colorante.

Preparación de Soluciones de Colorantes

Se sigue la siguiente técnica:

1. Pesar la cantidad exacta de colorante en polvo y colocarla en un matraz Erlenmeyer.
2. Añadir el diluyente (primero el alcohol) gradualmente.
3. Dejar reposar 24 horas y filtrar en un frasco color topacio.
4. Almacenar protegido de la luz solar directa.

Las etiquetas de las soluciones deben indicar la concentración del colorante y la fecha de preparación. Los colorantes deben conservarse en un lugar oscuro, fresco y bien cerrado.

Tipos de Tinciones

Se clasifican en:

1. Tinciones Simples: Utilizan un solo colorante. Proporcionan información sobre la forma, agrupación y cantidad de gérmenes. Ejemplos: tinción con azul de metileno, cristal violeta, safranina.
2. Tinciones Diferenciales: Utilizan dos colorantes, tiñendo los microorganismos de diferente color según su tipo. Ejemplos: tinción de Gram, tinción de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR).
3. Tinciones Estructurales: Utilizan colorantes específicos para revelar estructuras presentes en algunos microorganismos y ausentes en otros. Ejemplos: tinción de cápsulas, esporas, flagelos.

Preparación del Frotis

Se utilizan portaobjetos limpios y desengrasados. Los pasos son:

1. Extensión:
   • Si la muestra es líquida, se deposita una gota con un asa de inoculación (previamente flameada) y se extiende.
   • Si la muestra es sólida o semisólida, se deposita una gota de agua destilada o SSF y se suspende una pequeña cantidad de la muestra con el asa.
   • Si se usa un escobillón, se puede extender directamente o suspender en suero fisiológico estéril.
2. Desecación: Se deja secar al aire o sobre la llama (manteniendo el portaobjetos alto).
3. Fijación: Se adhiere la muestra al portaobjetos, generalmente mediante calor (pasando el portaobjetos 2-3 veces por la llama). También se pueden usar fijadores químicos (alcohol metílico, alcohol etílico).

Tinción Sencilla

Objetivo: Observar la forma, agrupación y cantidad de bacterias.

Colorante habitual: Azul de metileno de Loeffler (aunque se pueden usar otros como safranina o fucsina).

Material:

• Cultivo bacteriano o muestra
• Portaobjetos limpios y desengrasados
• Agua destilada
• Asa de platino, mechero, microscopio
• Cristalizador, paralelas
• Azul de Metileno de Loeffler (0.3 g de azul de metileno, 30 ml de alcohol etílico, 100 ml de agua destilada)

Técnica:

1. Extensión
2. Desecación
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Tinción: Cubrir con azul de metileno durante 1-2 minutos.
5. Lavado: Lavar con abundante agua (preferiblemente destilada).
6. Secado: Secar entre papel de filtro y al aire.
7. Observación: Usar el objetivo de inmersión con aceite de cedro y el condensador alto.

Tinciones Diferenciales: Tinción de Gram

Fundamento: Diferencia las bacterias en Gram positivas (Gram (+)) y Gram negativas (Gram (-)) según la estructura de su pared celular.

Las bacterias Gram (+) retienen el cristal violeta (o violeta de genciana) después de la decoloración, mientras que las Gram (-) lo pierden.

Material: Similar a la tinción sencilla, pero con los siguientes colorantes y reactivos:

• Violeta de Genciana o Cristal violeta
• Lugol
• Fucsina fenicada o Safranina (colorante de contraste)
• Alcohol-acetona (decolorante)

(Se incluyen las composiciones detalladas de cada reactivo en el texto original, pero se omiten aquí por brevedad).

Técnica:

1. Extensión
2. Desecación
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir con cristal violeta (o violeta de genciana) durante 1.5-2 minutos.
5. Lavar ligeramente con agua.
6. Aplicar Lugol (mordiente) durante 2 minutos.
7. Decoloración: Escurrir el lugol, lavar con agua y decolorar con alcohol-acetona hasta que apenas se arrastre colorante violeta.
8. Lavar con agua abundante.
9. Coloración de contraste: Cubrir con fucsina fenicada o safranina durante 1-2 minutos.
10. Lavar con agua.
11. Secado.
12. Observación: Las bacterias Gram (+) se ven azul-violeta y las Gram (-) se ven rosa.

Posibles errores en la tinción de Gram:

• Precipitación del colorante.
• Contaminación de los reactivos.
• Artefactos coloreados.
• Mala técnica de coloración.
• Bacterias Gram (+) viejas o dañadas pueden aparecer como Gram (-).
• Algunas bacterias Gram (+) se decoloran fácilmente.
• Bacterias que se tiñen débilmente pueden pasar desapercibidas.
• Algunos microorganismos no se tiñen con esta técnica.

Tinciones Estructurales: Tinción de Esporas

Fundamento: Algunas bacterias forman esporas (formas de resistencia). La tinción de esporas aprovecha la impermeabilidad de su pared.

Se fuerza la coloración con calor, y durante la decoloración, solo las esporas retienen el colorante.

Se requieren cultivos de al menos 48 horas.

Material:

• Cultivo de al menos 48 horas
• Solución de verde malaquita al 5% en agua destilada
• Colorante de contraste: safranina
• Portaobjetos, cristalizador, paralelas, algodón, alcohol, pinzas, microscopio, etc.

Técnica:

1. Extensión
2. Desecación
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir con verde malaquita al 5% y calentar a emisión de vapores durante 5 minutos (sin ebullición). Se puede usar papel de filtro impregnado con el colorante.
5. Dejar enfriar.
6. Lavar con abundante agua.
7. Colorante de contraste: Safranina durante 1 minuto.
8. Lavar con agua.
9. Secar y observar. Las esporas se verán verdes y las células vegetativas rosas.

La disposición y tamaño de las esporas son importantes en taxonomía.