Extracción y Purificación de la Invertasa de Levadura
Agentes Utilizados en la Ruptura Celular y Solubilización de la Invertasa
- Acetato Sódico: Se utiliza en el primer paso para la obtención de la invertasa de la levadura. Provoca la ruptura de la célula mediante un procedimiento autolítico debido a la presión osmótica a la que se someten las células.
- Tolueno: Disolvente orgánico que provoca la disolución de lípidos de membrana.
- Triptón: Detergente no iónico que disgrega casi completamente las membranas y provoca la ruptura de la levadura.
- EDTA: Quelante de iones que secuestra iones metálicos, principalmente divalentes, presentes en el medio. Estos iones pueden reducir la actividad de la enzima.
Precipitación de la Invertasa con Etanol
¿Qué sucede con la invertasa y cómo influye la adición de etanol?
La adición de etanol, un disolvente orgánico miscible en agua, es el siguiente método a aplicar en el proceso de purificación de la invertasa. Este proceso consiste en una precipitación por adición de etanol.
- El efecto de la adición de etanol a una disolución de proteínas es la disminución de la solubilidad de estas debido a la disminución de la constante dieléctrica del medio y de la solvatación de las proteínas.
- El etanol también compite con las proteínas por las moléculas de agua del medio, disminuyendo su capa de hidratación y reduciendo considerablemente su solubilidad, lo que lleva a la precipitación de la muestra.
- Es importante realizar este proceso en frío, ya que la temperatura elevada afecta negativamente a la estabilidad de la enzima.
Precipitación Diferencial con Sulfato Amónico
¿Por qué la invertasa permanece en el sobrenadante después de añadir sulfato amónico al 75%?
Se realiza una precipitación diferencial por efecto salino utilizando sulfato amónico como sal. La invertasa presenta un elevado grado de glicosilación, lo que hace que su solubilidad en agua sea muy elevada. Por lo tanto, se mantiene en solución incluso en presencia de concentraciones elevadas de sal, mientras que muchas otras proteínas presentes en la preparación precipitan.
Cromatografía de Exclusión Molecular
¿Cuál es el objetivo de la cromatografía de exclusión molecular durante la purificación de la invertasa?
El objetivo es eliminar de la preparación enzimática las sustancias no proteicas de bajo peso molecular, como los restos de sulfato amónico y etanol arrastrados en las etapas anteriores.
¿Cuál es la contribución de la cromatografía de exclusión molecular en la purificación de la enzima?
Al realizar la cromatografía, el límite de exclusión del dextrano es de aproximadamente 5000 Dalton. Por lo tanto, las sustancias con un peso molecular inferior serán eluidas con posterioridad a las que tienen un peso molecular superior, como la invertasa. Esto facilita la detección de la invertasa y favorece la etapa de purificación.
Ensayo de la Actividad Enzimática de la Invertasa
¿Cuáles son las reacciones en el ensayo de la actividad enzimática?
La determinación de la actividad enzimática se basa en la medida de la cantidad de azúcares reductores liberados al medio durante un determinado periodo.
- Primera reacción: La preparación enzimática de la invertasa se incuba en presencia de su sustrato, la sacarosa, y en condiciones de pH y temperatura adecuadas durante un tiempo determinado. En esta incubación, la enzima hidroliza la sacarosa liberando al medio cantidades equimoleculares de glucosa y fructosa.
- Segunda reacción: La cantidad de glucosa y fructosa generada se valora mediante una reacción química basada en sus propiedades reductoras. Para ello, se añaden cantidades determinadas de una disolución de DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico), que es reducido a DAS (ácido 3-amino-5-nitrosalicílico). El DAS presenta un máximo de absorción a 530 nm, longitud de onda a la cual el DNS no absorbe prácticamente. Así, se permite determinar espectrofotométricamente la cantidad de DAS y relacionarla directamente con la cantidad de glucosa y fructosa liberadas por la enzima.
¿Por qué en la valoración de la actividad enzimática se añaden los reactivos a intervalos de 30 segundos?
En las condiciones experimentales de este ensayo, el tiempo de incubación adecuado es de 5 minutos. Por lo tanto, en cada tubo de ensayo, la invertasa debe ejercer su actividad catalítica exactamente durante ese tiempo. El tiempo debe ser exacto a intervalos precisos de 30 segundos al añadir tanto la sacarosa al principio como el DNS al final, para que la incubación posterior se ajuste al tiempo establecido.
Evolución de los Parámetros en un Proceso de Purificación
¿Cómo debe evolucionar la actividad total, la actividad específica y la cantidad de proteínas en un proceso de purificación?
- Actividad total: Puesto que en cada etapa del proceso de purificación se pierde una parte de la enzima, la fracción purificada debe presentar un valor de actividad total inferior al del extracto inicial o, en el mejor de los casos, igual.
- Actividad específica: Cuanto más enriquecida en invertasa esté la muestra, mayor será su actividad específica. Si el proceso de purificación se ha realizado correctamente, la fracción purificada tendrá una actividad específica mayor que el extracto inicial.
- Cantidad de proteínas: Al principio del proceso habrá una mayor cantidad de proteínas porque estarán mezcladas. Sin embargo, si lo relacionamos con el factor de purificación (FP), cuanto mayor sea el factor obtenido, más enriquecida en la enzima objeto de nuestro estudio estará la preparación enzimática y menos proteínas indeseables estarán presentes.
Diluciones para el Ensayo de Actividad Enzimática
Para realizar el ensayo se dispone de 5 disoluciones de sacarosa de concentración decreciente (0.3 M, 0.2 M, 0.15 M, 0.10 M y 0.075 M) que son utilizadas para determinar la actividad de la enzima. A partir de estas, se calcula la concentración de sustrato en el medio de incubación de la enzima a partir del volumen añadido de sustrato y del volumen del medio de incubación.