Técnicas de Microtomía

En histología, la microtomía es fundamental para obtener cortes delgados de tejidos que puedan ser observados al microscopio. Existen varios tipos de micrótomos, cada uno con sus propias características y aplicaciones:

Tipos de Micrótomos

1. Micrótomo de Deslizamiento: Utiliza una navaja móvil y un porta muestras fijo. Es adecuado para órganos completos y tejidos blandos y delicados, especialmente cuando se utilizan bloques de celoidina.
2. Micrótomo de Rotación (Minot): Es el más utilizado en anatomía patológica. Tiene un porta muestras móvil y una navaja fija. Permite obtener cortes seriados en cinta de parafina. Se usa rutinariamente para trozos pequeños de tejido.
3. Micrótomo de Congelación: Similar al de deslizamiento, pero utiliza CO2 para enfriar la navaja y el porta muestras. Produce cortes de 10-15 micrones. Es un método rápido para biopsias urgentes.
4. Criostato: Es un micrótomo rotatorio inmerso en una cámara fría a -25°C. Utiliza agua o gas freón para enfriar la muestra. Permite obtener cortes finos de 7 micrones. Se usa para cortes sin fijar y biopsias rápidas, permitiendo la tinción con H&E.
5. Ultramicrótomo: Se utiliza para obtener cortes ultrafinos para microscopía electrónica.

Navajas

Las navajas utilizadas en microtomía varían según el tipo de tejido y el micrótomo:

• Acero Inoxidable: Para moldes de parafina.
• Carburo: Para moldes de resina y huesos sin descalcificar.
• Vidrio, Zafiro o Diamante: Para moldes plásticos.
• Desechables: Para cortes de parafina.

Tipos de Filos de Navajas de Acero

• Filo A (Bicóncava): Una cara, para micrótomos de deslizamiento e inclusiones en celoidina. Adecuado para cortes duros.
• Filo B (Plana/Cóncava): Para cortes de congelación e inclusiones en celoidina. No apta para parafina.
• Filo C (Cuneiforme Biplana): Para moldes de parafina en micrótomos rotatorios y de congelación.
• Filo D (Forma de Cepillo): Para ultramicrótomos e inclusiones en plástico.

Navajas Desechables

• Perfil Alto: Para tejido blando.
• Perfil Bajo: Para cortes de rutina o delicados.

Medios Adhesivos y de Montaje

Medios Adhesivos

Se utilizan para asegurar que los cortes de tejido se adhieran al portaobjetos:

• Albúmina de Mayer: Mezcla de clara de huevo, glicerina y cristal.
• Cola Fría 1%
• Poli-L-Lisina
• Silano

Medios de Montaje

Se utilizan para preservar los cortes teñidos y facilitar la observación al microscopio:

• Anhidros: Resinas naturales o sintéticas.
• Acuosos: Glicerina.

Importante: Tinción hidrosoluble requiere montaje hidrofóbico. Deshidratado con colorante no iónico requiere montaje hidrosoluble e hidratación. Los medios hidrofóbicos son permanentes, con refringencia similar al vidrio.

Entellan: Polímero de xilol, para deshidratados, se seca a temperatura ambiente, incoloro, resistente al calor y no miscible en agua.

Descalcificación

La descalcificación es necesaria para tejidos óseos antes de realizar cortes:

Métodos de Descalcificación

1. Ácidos:
   • Ácido Nítrico: Rápido, forma nitrato de calcio, tiempo menor a 48 horas.
   • Ácido Fórmico: Conserva mejor el tejido para tinción, se usa en solución acuosa con formalina neutra al 10%.
   • Anamorse: Solución concentrada de citrato de sodio y ácido fórmico.
   • Bouin: Fija y descalcifica levemente, se usa en rutina para tejido óseo.

Control de Descalcificación

1. Método Manual: Tacto flexible del tejido.
2. Rayos X
3. Test Químico

Coloración

La coloración es esencial para visualizar las estructuras celulares y tisulares. El proceso termina cuando el colorante no se elimina al lavar.

Mecanismos de Tinción

Los mecanismos de tinción involucran interacciones físico-químicas:

1. Afinidad Química: Interacción ácido-base entre el tejido y el colorante.

• Ácidas: ADN, ARN, cartílago, lípidos conjugados, células cebadas, secreciones mucosas. Se tiñen con colorantes básicos o catiónicos.
• Básicas: Colágeno. Se tiñen con colorantes ácidos.
• Anfotéricas: Se tiñen según el pH.

Densidad de Estructura: Mayor densidad, mayor tinción. Permeabilidad y Difusión: Depende de la capacidad de penetración del colorante y la oposición del tejido.

Formas de Tinción

Las formas de tinción incluyen:

• Covalente
• Iónica
• Puentes de Hidrógeno
• Transferencia de Cargas
• Fuerzas de Van der Waals
• Interacciones Hidrofóbicas
• Mordientes

Factores de Coloración

Los factores que influyen en la coloración son:

Del Colorante

• Concentración
• Solvente
• Fuerza Iónica
• Temperatura (acelera)
• pH

Del Tejido

• Químicas
• Fisicoquímicas
• Tratamientos Previos (fijación)

Clasificación de Colorantes

• Directa: Alta afinidad por el tejido.
• Indirecta: Uso de mordiente intermediario.

Mordientes

Unen firmemente el colorante al tejido. Se usan alumbres, sales de aluminio y hierro.

• Alumbre de K, Cr, Amonio, Fe.

Laca: Material bi/multivalente. El colorante debe tener H que se sustituya por metal. El tejido tiene un átomo dador de electrones (oxígeno).

Unión Mordiente-Colorante

• Primaria: Sustituye metal por H del colorante.
• Secundaria: Unión metal y átomo que cede electrones.

Tipos de Mordientes

1. Metálicos Disociables: No se usan en tinción de hematoxilina porque tiñen homogéneamente.
2. Oxidantes: Se usan en tinción de hematoxilina. Óxidos metálicos, cloruros metálicos, metaloides orgánicos.
3. Alumbres: Sales que se unen a los tejidos actuando como intermediarios.

Métodos de Coloración

1. Forma de Unión:
   • Directa: Alta afinidad.
   • Indirecta: Mordiente que forma quelato o laca que une.
2. Forma de Teñir:
   • Ortocromático: Mismo color que el colorante.
   • Metacromático: Tiñe distinto al colorante (ej. azules de toluidina y metileno tiñen morado).
   • Cromotropas: Radicales en el tejido derivados de grupos sulfónico, carboxílico o fosfatos.
3. Tiempo de Tinción:
   • Progresiva: Normal.
   • Regresiva: Sobre tinción y uso de líquido diferenciador para eliminar el exceso de colorante.
4. Elementos del Tejido Coloreado:
   • Simple: Algunos elementos.
   • Combinada: Varios elementos a la vez.
5. Cantidad de Colorantes:
   • Panóptica: Coloración combinada sucesiva.
   • Pancrómica: Un solo baño con todos los colorantes actuando simultáneamente.
6. Volumen Teñido:
   • En Masa: Tiñe el trozo antes de incluirlo (ej. Golgi, espiroquetas).
   • En Corte: Tiñe el tejido después de cortarlo en el micrótomo.

Hematoxilina y Eosina

Hematoxilina

Es un colorante básico que tiñe estructuras ácidas (heterocromatina, nucléolo, ARN, MEC) de color azul/violeta. Es natural, soluble en agua y alcohol. Se potencia con ácido acético.

Eosina

Es un colorante ácido que tiñe estructuras básicas (filamentos citoplasmáticos, componentes membranosos, fibras) de color rosado. Es menos específica, derivada de xantenos, difunde fácilmente. Se usa en soluciones acuosas o alcohólicas al 1%.

Hematoxilina de Mayer

Es selectiva y tiñe de forma progresiva. Es menos ácida que la de Harris.

Eosina

Es menos específica, derivada de xantenos, difunde fácilmente. Se usa en soluciones acuosas o alcohólicas al 1%.