Técnicas de Preparación de Muestras para Microscopía Óptica: Causas de una Mala Imagen

No podemos estudiar una muestra sin antes llevar a cabo una preparación de la misma para poder observarla. La preparación del objeto de estudio puede resultar un proceso simple o, por el contrario, ser bastante complejo, dependiendo de la naturaleza y características de aquello que queremos observar.

La preparación de una muestra para estudiarla al microscopio óptico es diferente según la naturaleza del material que ha de ser observado, orgánico o inorgánico, y si es orgánico, según queramos observar propiedades que sólo se manifiestan en estado vivo, o si queremos observar morfología y estructuras, que no se modifican cuando sobreviene la muerte celular.

4.1. Estudio “in vivo»

El estudio «in vivo» se desarrolló cuando todavía no se habían inventado la fijación y la tinción. Actualmente se siguen utilizando, sobre todo gracias al desarrollo de las técnicas de contraste de fases y contraste interferencial.

Estas técnicas concretas, que sólo se pueden emplear para observar preparaciones y objetos suficientemente finos, se suelen utilizar para el estudio de protozoos y hongos.

La observación vital se utiliza principalmente para la investigación de los caracteres de movilidad bacteriana y morfología (en bacterias que al secarse se alteran), agrupación y estructuras de resistencia (quistes) de parásitos.

Un estudio “in vivo» es aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten las células, como es la fijación o la inclusión.

No presenta dificultades añadidas a las de cualquier técnica microscópica, pero sí que requiere la máxima limpieza.

Hay diversas técnicas para la observación vital:

a) Examen en fresco.

• Preparaciones húmedas: para observar organismos acuáticos microscópicos (algas, larvas, etc.). Se pone una gota del líquido que los contiene sobre el portaobjetos y se pone el cubreobjetos con cuidado para que no aparezcan burbujas de aire.
• Gota pendiente: se utilizan portaobjetos excavados sobre los que se pone el cubreobjetos, que lleva adherido la gota del líquido que ha de ser observado. Así podemos observar el movimiento de los microorganismos en el medio líquido, sin que estén sometidos a la presión entre portaobjetos y cubreobjetos. Esta técnica presenta varios problemas que hay que tener en cuenta:
  1. La gota constituye una lente trémula que desvía los rayos de luz e interfiere con la iluminación, esto resulta muy molesto cuando se emplea microscopio de contraste de fases.
  2. Los portaobjetos excavados actúan como una lente divergente que puede modificar la realidad de lo que se está observando.
• Examen en fresco con nigrosina: esta técnica consiste en añadir nigrosina, se prefiere a la tinta china, al objeto de estudio. Con este método podemos distinguir bacterias incoloras sobre fondo negro. Se utiliza sobre todo para el estudio de detalles estructurales como cápsulas y flagelos. Se utiliza el objetivo de inmersión.

En el examen en fresco se pueden utilizar dos tipos de medios, los líquidos fisiológicos o los líquidos de adición. Los líquidos fisiológicos son los que conservan las condiciones más parecidas a aquellas en las que se desenvuelve el microorganismo vivo. Los líquidos de adición se utilizan para aclarar los objetos de estudio poco transparentes (insectos, pelos, fragmentos vegetales) y así hacerlos visibles. Como líquidos de adición se utilizan el lactofenol o el clorofenol.

b) Coloración vital.

Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar al organismo. En general no tiñen, sino que se acumulan en determinadas zonas de la célula. Como todo colorante es una sustancia tóxica, por lo que hay que emplear bajas concentraciones. Como colorantes vitales se utilizan el azul de metileno, el rojo neutro, el rojo congo, el verde Jannus.

La coloración en vivo se puede hacer de dos maneras:

1. Por difusión: en el espacio entre portaobjetos y cubreobjetos de una preparación en fresco, se pone una gota de colorante que penetra en la muestra por capilaridad.
2. Mezclando una gota de colorante con el material que ha de ser examinado en el portaobjetos y colocando luego el cubreobjetos.

Tanto en un examen en fresco como en una coloración vital pueden realizarse procedimientos de microcompresión, disociación, e incluso fragmentación.

4.2. Estudio “in vitro»

Consiste en la observación de células y tejidos muertos. Para ello se realizan una serie de pasos, como son la fijación, la inclusión, el corte (microtomía), la tinción y el montaje.

1. Fijación:

Mecanismo que consiste en matar a la célula lo más rápidamente posible, para permitir que se mantengan las propiedades fisiológicas y morfológicas del organismo vivo. Los fijadores solidifican el coloide protoplasmático mediante coagulación o precipitación, convirtiéndolo en un gel insoluble.

La fijación evita que el tejido se pudra y se desintegre, produciendo puentes entre proteínas y diferentes materiales de los tejidos. 24 horas después se procederá a la inclusión.

Hay diferentes tipos de fijador:

• Físicos: calor (húmedo o seco), frío (congelación rápida).
• Químicos: según la base fijadora: alcohol metílico, dicromato de potasio, erlinck, formol 10% tamponado.

La muestra que va a ser fijada no debe tener más de tres milímetros de espesor, porque, de lo contrario, el fijador, que penetra por difusión, no actuaría por igual en todas las células de la muestra. Además, el líquido fijador debe exceder en 50:1 al de la muestra. Hay que tener en cuenta que los líquidos fijadores son volátiles y que el recipiente donde se vaya a dar la fijación debe ser cerrado.

Existe un tiempo adecuado de fijación, que no debe excederse; una vez concluido, se lava la muestra para quitar el exceso de fijador.

Además de mantener las propiedades del objeto de estudio, los fijadores, dependiendo de los casos, pueden servir para endurecerlo, o ablandarlo, o aumentar su afinidad tintorial.

2. Inclusión:

Es el procedimiento por el cual la muestra es tratada para darle consistencia y así facilitar el corte de delgadas láminas, permitiendo además la conservación de la misma por mucho tiempo.

Para endurecerla, la incluimos en un material que llegue a todas las estructuras celulares: sustancia con plasticidad: parafina, el colodión (nitrocelulosa en alcohol/éter) o la gelatina.

Lo más corriente es utilizar la parafina. Por ello detallamos el proceso de inclusión en ella:

1. Deshidratación: proceso necesario para que, a pesar de la insolubilidad de la parafina, ésta pueda impregnar la pieza. Consiste en hacer pasar la muestra por una gradación creciente de alcoholes. Los tiempos dependen de si el proceso se realiza manualmente o automáticamente, en cuyo caso se utiliza un histoquinéter.
2. Aclaración/lavado: se baña la pieza tres veces durante unos 30-40 minutos en un disolvente de la parafina, como el xilol, el benzol o el toluol.
3. Impregnación en parafina: para evaporar el disolvente de la parafina y que ésta pueda penetrar en la pieza, se la sumerge en parafina fundida dos veces, durante 5 horas cada vez (24 horas a 56-60ºC).
4. Inclusión definitiva: la pieza se sumerge en parafina fundida depositada en moldes, normalmente en «cassettes» de parafina, para que al enfriarse podamos obtener bloques de parafina que incluyen la pieza.

3. Corte:

La obtención de cortes para su estudio microscópico se realiza mediante micrótomos.

Hay de diferentes tipos que se eligen dependiendo de la textura del material que se ha de estudiar.

Para cortes de células vegetales de un órgano duro se utiliza el micrótomo de mano o de Ranvier.

Para el resto de órganos vegetales y para órganos animales se utiliza el micrótomo de rotación o de Minot, o el de deslizamiento.

Se pueden cortes finos de 5 a 10 µm de grosor, y semifinos 0,5 a 5 µm de grosor. Los cortes semifinos se realizan a partir de material incluido en plástico y no en parafina.

Los cortes obtenidos se planchan en la superficie de un baño maría a 45ºC con un 5% de gelatina, y se pescan con el portaobjetos.

También se pueden realizar cortes a partir de material no incluido en parafina, mediante congelación. Esta técnica es muy interesante por su rapidez, pero sólo se pueden obtener cortes de 60 a 80 µm de grosor.

Los cortes, una vez recogidos y puestos en agua, se tiñen para evitar que se sequen.

4. Tinción:

Para teñir los cortes éstos no deben tener parafina porque si no, no penetraría el colorante.

Por ello, si antes han sido incluidos en parafina, se elimina sumergiendo los cortes 15 minutos en xilol También se elimina el xilol haciéndolos pasar por alcohol absoluto, alcohol 90º, alcohol 70º y agua destilada.

Una vez eliminada la parafina, o bien utilizando los cortes que no habían sido incluidos en ella, se procede a la tinción.

Hay muchos tipos de tinciones, muchas de ellas específicas para poder observar determinadas estructuras:

a) Según su origen:

• Naturales: proceden de animales o de vegetales: eosina azafrán, carmín de cochinilla, etc.
• Artificiales: proceden del carbón mineral. Son los que más se utilizan.

b) Según su naturaleza:

• Ácidos: tiñen lo básico. Ejemplo: eosina
• Básicos: tiñen lo ácido. Ejemplo: azul de metileno.
• Neutros: tanto la parte aniónica como la catiónica son colorantes.

Existen dos tipos de técnicas de coloración:

• Vitales o en vivo: el colorante no provoca la muerte celular. Ejemplos: azul de metileno, rojo neutro.
• Supravitales: los colorantes se aplican cuando el material ya ha muerto a causa de la fijación.

Hay tinciones que son bastante rutinarias y frecuentes, como la hematoxilina-eosina en animal, el fast green-safranina en vegetal o el Gram para bacterias. Pero hay muchísimas más que sólo se aplican en determinados casos: tinción de Herovici, tinción de la reticulina o tinción del tricrómico de Masson. Todas estas técnicas de tinción han sido desarrolladas por muy diversos investigadores, como Golgi, Cajal, Cox, Ehrlich o May-Grunwald.

Una vez teñidos los cortes, se deshidratan para quitarles el agua y que ésta no produzca cambios en la refringencia. Para ello se pasan los cortes por alcohol en gradación creciente, hasta acabar en alcohol puro. Después se aclaran con dos baños de xilol.

5. Montaje:

Hay varios tipos de montaje:

• Gota pendiente: ya explicado anteriormente. Se untan los bordes del cubreobjetos con vaselina para conseguir adherencia y que no se seque la muestra, si se va a observar durante más de una hora.
• Extensión o frotis: se extiende la gota sobre el portaobjetos con ayuda de otro portaobjetos, muy rápidamente para que no se dé coagulación. El líquido extendido se fija, colorea y monta de manera normal. Se suele utilizar en el estudio de sangre y de bacterias.
• Aplastamiento: es la técnica más común. Los cortes se depositan en el portaobjetos. Si no se quiere conservar la preparación, no añadiremos medio de montaje, sólo pondremos el cubreobjetos, pero la preparación no durará más de una hora, ya que su contenido líquido se evaporará por el calor emitido por el foco luminoso. Si la preparación se quiere conservar, utilizaremos un buen medio de montaje que debe cumplir una serie de propiedades como tener un buen índice de refracción, un pH neutro, y un secado rápido. Tradicionalmente se ha venido utilizando el bálsamo de Canadá, que actualmente ha sido sustituido por resinas sintéticas, como el Eukitt.

Gracias al medio de montaje, la preparación se conservará durante mucho tiempo. Una vez añadida la gota de medio de montaje, se cubre con el cubreobjetos y se espera a su secado.

6. Etiquetaje:

Las preparaciones deben etiquetarse, si es que se quieren conservar o se van a utilizar posteriormente. En la etiqueta se pone el nombre del material, la especie, la técnica utilizada y la fecha de realización.

Instrucciones para el Montaje Húmedo

Utiliza un portaobjetos de vidrio para hacer el montaje húmedo. Éste deberá estar limpio y libre de polvo y otras partículas finas.

Succiona unas gotas de tu muestra líquida con un gotero.

Toma un portaobjetos plano de vidrio con una mano, sosteniéndolo por los bordes externos.

Coloca una gota de la muestra líquida del gotero sobre el portaobjetos. Asegúrate de que la gota quede en el centro del portaobjetos.

Deja el gotero. No inclines el portaobjetos que tienes en la otra mano mientras haces esto.

Usa tu mano libre para tomar cuidadosamente el cubreobjetos (son sumamente frágiles). Sostén el cubreobjetos por los bordes externos.

Coloca el cubreobjetos sobre el portaobjetos asegurándote de que los bordes de éste coincidan con los bordes del portaobjetos. No presiones sobre el cubreobjetos.

Continúa sosteniendo la combinación portaobjetos/cubreobjetos por los bordes externos. Debes tratar de mantenerlo lo más horizontal y firme posible, y colocarlo en la platina de tu microscopio.

Consejos y Advertencias

• La mayoría de los preparados en montaje húmedo se secan alrededor de la media hora. Puedes prolongar la humedad de la muestra en montaje húmedo aplicando una delgada capa de vaselina sobre los bordes externos del cubreobjetos. Presiona muy suavemente los bordes al colocar el cubreobjetos sobre tu portaobjetos. Esto produce un sellado que evitará que el líquido sobre el portaobjetos se seque demasiado rápido. Los preparados líquidos con sellado de vaselina normalmente duran 1 o 2 días.
• La clave para hacer un preparado en montaje húmedo es usar la cantidad justa de agua. Si no usas suficiente agua, el agua no sostendrá el cubreobjetos, lo que podría provocar que el mismo mate los organismos vivos del agua. Si usas demasiada agua, el cubreobjetos no se sostendrá sobre el portaobjetos.