La Purificación de Proteínas: Un Paso Esencial

La purificación de proteínas es fundamental para comprender su función. En bioquímica, se requiere purificar las sustancias de estudio, lo que puede ser complejo debido a la diversidad y complejidad de las células. Este documento explora las técnicas comunes para purificar proteínas.

Métodos de Detección de Proteínas

Para purificar una proteína, se necesita un método o ensayo para detectar su presencia de manera cuantitativa. Los ensayos de actividad enzimática son convenientes, mientras que las proteínas no enzimáticas requieren métodos más específicos.

Ejemplo: El NADH absorbe luz a 340 nm, lo que se utiliza para medir la actividad de la lactato deshidrogenasa.

Rotura Celular y Extracción de Proteínas

El primer paso es romper las células para extraer las proteínas. El método elegido depende del tipo de célula y la localización de la proteína.

Lisis Celular

Válido para células sin pared celular (animales). Se suspenden las células en una solución hipotónica, causando su hinchamiento y rotura por diferencia osmótica.

Destrucción Mecánica

• Homogenización: Pasar las células entre un tubo y un pistón.
• Mortero: Moler con arena o alúmina.
• Molino con perlas: Usar perlas de vidrio para romper las células.
• Prensa de French: Pasar las células a alta presión por un orificio.
• Sonicación: Someter las células a vibraciones de ultrasonido.

Centrifugación Diferencial

Tras la rotura celular, se centrifuga el homogenado a diferentes velocidades para separar componentes celulares.

Técnicas de Purificación de Proteínas

Las proteínas se purifican según sus propiedades físicas y químicas:

Precipitación Salina

Las proteínas son menos solubles a altas concentraciones de sal. La diálisis se usa para eliminar la sal.

Cromatografía de Filtración en Gel

Separa proteínas por tamaño. Las proteínas grandes se eluyen primero.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Separa proteínas por carga neta. Las proteínas con carga positiva se unen a una columna con grupos carboxilato y se eluyen con NaCl.

Cromatografía de Afinidad

Aprovecha la afinidad de las proteínas por ligandos específicos. Ejemplo: las lectinas se purifican con columnas de glucosa.

Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC)

Sistema automatizado que utiliza altas presiones para una purificación rápida y de alta resolución.

Electroforesis en Gel

Separa proteínas en un gel de poliacrilamida bajo un campo eléctrico.

Electroforesis Nativa

Separa proteínas por su relación carga/masa.

Electroforesis Desnaturalizante (SDS-PAGE)

El detergente SDS desnaturaliza las proteínas y las separa por masa. Permite calcular el peso molecular.

Isoelectroenfoque

Separa proteínas por su punto isoeléctrico (pI), el pH al que su carga neta es cero.

Electroforesis Bidimensional

Combina isoelectroenfoque y SDS-PAGE para una separación de alta resolución.

Ultracentrifugación

Separa biomoléculas y determina sus masas moleculares mediante una fuerza centrífuga.

• Coeficiente de Sedimentación (S): Describe la velocidad de sedimentación de una partícula.
• Centrifugación en Gradiente: Separa proteínas con diferentes coeficientes de sedimentación.
• Equilibrio de Sedimentación: Determina el peso molecular de las proteínas.

Cuantificación de Proteínas

Método de Biuret

Basado en la formación de un complejo coloreado entre Cu2+ y los enlaces peptídicos.

Método de Bradford

Basado en la unión del colorante Coomassie Blue G-250 a las proteínas.

Secuenciación de Proteínas

El método de Edman se utiliza para determinar la secuencia de aminoácidos de las proteínas.

ELISA y Western Blot

ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción Asociado a Enzima): Detecta la presencia de antígenos o anticuerpos utilizando enzimas y anticuerpos específicos.

Western Blot: Detecta proteínas separadas por electroforesis utilizando anticuerpos específicos.

Estas técnicas son herramientas valiosas para la investigación y el análisis de proteínas.