Técnicas de Separación: Cromatografía y Electroforesis
La separación de componentes en una mezcla es fundamental en diversas áreas de la ciencia y la industria. A continuación, se describen dos técnicas esenciales: la cromatografía y la electroforesis.
1. Cromatografía
La cromatografía es un método físico de separación utilizado para caracterizar mezclas complejas, con aplicaciones en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas o líquido) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria, que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla que son arrastrados por la fase móvil interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria, migrando a diferentes velocidades. De este modo, los componentes de la mezcla viajan a lo largo de la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.
1.2 Cromatografía sobre Papel
La cromatografía en papel es un método usado en laboratorios para análisis cualitativos que no requiere equipamiento especial. Utiliza una tira de papel de filtro como fase estacionaria y un disolvente como fase móvil.
El papel, hecho de fibras de celulosa, permite que las moléculas se muevan, mientras que la fase móvil disuelve y arrastra los componentes. La velocidad a la que se mueven depende de la interacción entre ambas fases.
Se coloca una muestra en el papel y el disolvente asciende por capilaridad. Después de unos minutos, se retira y se seca. Si las sustancias tienen color, se verán manchas de distintos colores; si no, se utiliza un revelador para visualizarlas. Finalmente, se calculan los factores de retardo (Rf) para identificar los componentes.
1.3 Cromatografía en Capa Fina
En la cromatografía en capa fina, la fase estacionaria es una capa uniforme y delgada de un absorbente mantenido sobre una placa. Los absorbentes o fase estacionaria, generalmente, son gel de sílice o alúmina. En este caso, la fase móvil es un disolvente, y la fase estacionaria es un sólido (gel de sílice o alúmina). La fase estacionaria es un componente polar y el disolvente es menos polar, de forma que los componentes menos polares se desplazarán con mayor velocidad. La separación se produce por migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en que se mueve la fase móvil.
1.4 Cromatografía en Columna
La columna está rellena con un material sólido con las características químicas adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada con la muestra se hace pasar a través de la columna (fase móvil). La muestra se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco viajando a lo largo de la columna con la fase móvil (eluyente). Cada componente migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria.
1.5 Cromatografía de Gases
Se denomina así porque la fase móvil es un gas y la fase estacionaria es un líquido adsorbido sobre un material inerte de relleno. Es una técnica analítica muy poderosa para análisis de volúmenes muy pequeños de muestra, tanto cualitativa como cuantitativamente. Esta técnica está limitada al análisis de compuestos volátiles y estables térmicamente.
Partes del equipo:
- Botella de gases.
- Regulador de caudal.
- Manómetro.
- Rotámetro (medidor de caudal).
- Divisor de flujo.
- Inyector (para introducir la muestra).
- Columna.
- Detector.
- Amplificador.
- Registro.
- Horno.
- Micro-jeringa.
1.6 Cromatografía Líquida
Recibe su nombre al ser la fase móvil un líquido que pasa a elevada presión a lo largo de la columna, para ello es necesario el uso de bombas de alta presión.
Partes del equipo:
- Depósitos disolventes
- Filtros
- Válvulas dosificadoras
- Bomba
- Amortiguador de impulso
- Inyector
- Pre columna
- Columna
- Detector
- Registro
- Deshecho
2. Electroforesis
Es una técnica que permite identificar y cuantificar moléculas. Su principal aplicación es en el campo de las biomoléculas (análisis de ADN, proteínas, etc.). La separación de las moléculas por electroforesis es debida a la diferente movilidad que presentan las moléculas bajo la acción del campo eléctrico, a través de una matriz porosa (gel). El gel es un polímero de porosidad controlable, formado por fibras cruzadas. Al poner la mezcla de moléculas sobre los pocillos y aplicar un campo eléctrico, estas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel. Las más pequeñas se moverán mejor, es decir, más rápidamente que las más grandes al pasar con mayor facilidad a través de los poros del gel. La información que se puede obtener tras realizar una electroforesis es cualitativa y cuantitativa.
Modo de trabajar en la electroforesis:
Preparación del gel: se pesa la cantidad necesaria de reactivo calentando en microondas, homogenizando y se le añade los reactivos necesarios. Finalmente se vierte sobre la cubeta previa colocación del peine (para formar los pocillos, pequeños huecos donde se cargaran las muestras y patrones) y se deja solidificar. Una vez gelificado el gel se retira el peine y se coloca en la cubeta de electroforesis, añadiendo disolución buffer para cerrar el circuito, dejando el gel totalmente sumergido unos 5 o 6 mm.
Preparación de la muestra: la muestra hay que tratarla previamente y para ello se le adiciona un tampón, glicerol (para que la muestra se deposite en el fondo del pocillo) y un colorante azul de bromofenol (que facilita su siembra y permite visualizar el frente de avance, para decidir cuándo cortar la corriente eléctrica). Una vez preparada la muestra se introduce en los pocillos con ayuda de una micropipeta. Corrida del gel: una vez cargadas las muestras y los patrones (MPM, marcadores de pesos moleculares conocidos) se conecta la fuente de alimentación, es decir, se aplica el voltaje necesario y las biomoléculas comenzaran a viajar a largo del gel. Se debe observar el frente de avance y cortar la corriente, cuando el mismo este unos próximo el extremo final del gel.
Revelado: para revelar las bandas (conjunto de moléculas) se utilizan diferentes técnicas. Para moléculas de ADN se añade bromuro de etilo en el gel que al unirse a las moléculas de ADN bajo la luz de una lámpara ultravioleta presenta luminosidad.